РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Об'єкти дослідження
У роботi використовували наступні штами дріжджів із колекції Інституту біології клітини НАН України:
Candida boidinii T2A;
Hansenula polymorpha 356 лінії DL1;
Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX) - безкаталазний мутант метилотрофних дріжджів з порушеною катаболітною репресією;
Saccharomyces cerevisiae S-288С;
Pichia guilliermondii АТСС 9058;
штами термотолерантних дріжджів Saccharomyces cerevisiae IZR-42, Saccharomyces cerevisiae IZR-106, виділені із Еволюційних Каньйонів, передані професором Eviator Nevo (Institute of Evolution, University of Haifa, Ізраїль).
Штами, отримані із ВКМ:
Hansenula anomala Y-155;
Kluyveromyces lactis Y-762;
Kluyveromyces thermotolerans Y-894;
Pichia fermentas Y-1375;
Rhodotorula pilimanae Y-1977;
Yarrowia lipolytica Y-917.
Штам із колекції кафедри мікробіології ЛНУ ім. І.Франка (Львів, Україна):
Schizosaccharomyces pombe D-9-S.
2.2. Умови культивування
Вихідні штами зберігали на скосах із сусло-агаром.
Дріжджі вирощували до середини логарифмічної або стаціонарної фази росту (в залежності від експерименту) в колбах Ерленмейера на круговому шейкері (240 об./хв) при 300С в середовищі Беркгольдера - СБ [18] наступного складу: КН2РО4 - (0,5 - 1) г/л; (NH4) 2SO4 - (3 - 3,5) г/л; MgSO4?7H2O - (0,2 - 0,5) г/л; CaCl2 - 0,1 г/л; сіль Мора - (0,2 мг - 1). До СБ додавали дріжджовий екстракт "Дiфко" до 0,075%. В залежності від мети експерименту, використовувались різні джерела вуглецю та енергії: глюкоза (Glc); L-лактат натрію (Lact), етанол (EtOH), гліцерол (GlОН) чи їх суміші в різних співвідношеннях.
2.3. Визначення концентрації клітин
Біомасу клітин (в мг абсолютної маси на 1 мл суспензії) визначали за мутністю розведених суспензій шляхом їх фотометрування на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М (при 540 нм, кювета 3 мм, світлофільтр № 6), відносно кривої гравіметричного калібрування.
Розрахунок проводили за формулою:
,
де Е - оптична густина при 540 нм;
n - розведення вихідної суспензії;
1,33 - коефіцієнт перерахунку, визначений при калібруванні гравіметричним методом.
2.4. Пермеабiлiзацiя клiтин H. рolymorpha
Відмиту від середовища біомасу клітин ресуспензували у 50 мМ K-Na-фосфатному буфері, рН 7,8, що містив 2 мМ ЕДТА, до концентрації клітин 20 - 50 мг/мл (у перерахунку на суху масу). До суспензії клітин додавали рівний об'єм водного розчину дигiтонiну або цетилтриметиламоній броміду (2 мг/мл). Сумiш iнкубували на водянiй лазні при 30 oС з перемішуванням кожнi 2 - 3 хв упродовж 15 хв. Пiсля пермеабiлiзацiї клітини тричi вiдмивали відповідним буфером. Пермеабiлiзовані клiтини H. рolymorpha використовували для визначення активності ФЦ b2 та неспецифічних ферохелатредуктаз. Концентрацiю "тiней"
H. polymorpha (пермеабілізованих клітин) визначали як у випадку iнтактних клiтин (див. 2.3).
2.5. Отримання безклiтинного екстракту
Вирощені клiтини дріжджів промивали двiчi водою та один раз 10 мМ
К,Nа-фосфатним буфером, рН 7,8. Далі до осаду клітин додавали 50 мМ К,Nа-фосфатний буфер, pH 7,8 з 2 мМ ЕДТА до кiнцевої концентрацiї клiтин 90 - 100 мг/мл та інгібітор протеїназ фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) у концентрації 0,4 мМ. Одержану суспензiю розливали в "стаканчики" для гомогенiзацiї, вносили склянi кульки (дiаметр 0,45 - 0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на планетарному гомогенiзаторi упродовж 5 хв при 1000 об./хв при +40С.
2.6. Визначення концентрації білка
Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі, який грунтується на утворенні забарвлених продуктів реакції ароматичних амінокислот з реактивом Фоліна у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв'язки [104]. Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика.
2.7. Визначення активностi флавоцитохрому b2 [27, 28]
Активність флавоцитохрому b2 визначали спектрофотометрично, за рівнем відновлення фериціаніду калію, при l = 420 нм. При цьому відбувається поступове знебарвлення реакційної суміші.
Реакційна суміш наступного складу:
0,03 М фосфатний буфер, рН 8,0;
0,03 М лактат натрію;
1 мМ ЕДТА;
0,83 мМ фериціанід калію (К3Fe(CN)6);
0,1 мл екстракту.
Питому активність розраховували за формулою:
де - зміна оптичної густини при l = 420 нм за хвилину;
Vp - об'єм реакційної суміші, мл;
n - розведення екстракту;
ЕмМ - молярна екстинція фериціаніду калію, рівна 1,04 мМ-1•см-1;
V - об'єм екстракту, мл;
Сб - концентрація білка в екстракті мг/мл.
2.8. Визначення вмісту лактату у культуральному середовищі ензиматичним методом [133]
Реакційна суміш містила дослідний зразок, 2 мМ NAD+, 2 од./мл
L-лактатдегідрогенази у 80 мМ гліцин-гідразиновому буфері, рН 9,5. Вимірювання оптичної густини проводили при 340 нм у 1 см кюветі. Концентрацію лактату визначали за попередньо побудованою калібрувальною кривою.
2.9. Проведення нативного електрофорезу та виявлення зон лактатдегідрогеназної активності ФЦ b2 в ПААГ
2.9.1. Умови проведення електрофорезу
Використовували Тріс-гліциновий електрофоретичний буфер, рН 8,3 [119] при 4 0С. Враховуючи, що ізоелектрична точка ФЦ b2 близька 5,6, електрофорез проводили від "-" до "+" 15 хв при 100 В, 13 мА (для фази концентрування) і 1,5-2 год при 220 В, 24 мA (для фази розділення), в градієнтній гелевій пластинці, що містила:
а) концентруючий гель (3 мл):
Н2О 2,1 мл;
30 % суміш акриламіду/метилен-бісакриламіду 0,5 мл;
1,0 М тріс (рН 6,8) 0,38 мл;
10 % персульфат калію 0,03 мл;
ТЕМЕD