РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Методы исследования гормонального состава и режимы низкотемпературного
хранения криоэкстракта плаценты.
Конечной целью нашей работы является разработка новых методов коррекции
эстрогендефицитных состояний у женщин, поэтому нам представилось необходимым
оценить состав криоэкстракта плаценты относительно содержания в нем главных
гормонов гипофизарно - гонадной системы, а также гипофизарно- надпочечниковой
системы - кортизола и проследить влияние на него низких температур при
различных режимах хранения, т.к. согласно данным литературы на сохранность
белковых структур оказывают влияние не только процессы замораживания и
отогрева, но и длительность хранения при низких температурах [118].
Материалом для исследования являлся препарат «Криоцелл - криоэкстракт
плаценты», изготовленный согласно методическим рекомендациям Института проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины. Плацента заготавливалась во время
операции кесарева сечения, донорами являлись здоровые женщины, у которых
беременность протекала нормально и которые были обследованы на наличие основных
инфекций [36].Препарат представляет собой криоконсервированный экстракт
плаценты на физиологическом растворе, полученный после мелкодисперсного
фрагментирования ткани человеческой плаценты, расфасованный в одноразовые
контейнеры по 1,5 мл. Содержание в криоэкстракте гормонов - ФСГ и ЛГ,
пролактина, эстрадиола, тестостерона, прогестерона, кортизола - определяли
методом твердофазного иммуноферментного анализа, с использованием готовой
тест-системы «Алькор-био» (СПб, Россия) [109]. Все абсолютные величины
содержания гормонов, определявшиеся в криоэкстракте плаценты, были
пронормированы на концентрацию белка в пробе. Содержание общего белка
определяли унифицированным методом по биуретовой реакции. Концентрацию гормонов
в экстракте плаценты оценивали при следующих режимах хранения:I – 1 сутки +
4єС; II– 10 суток -20єС; III– 10 суток -20єС, затем 1 год при -196єС; ІV- 1 год
при -20єС. Выбор режимов определялся необходимостью хранения криоэкстракта
плаценты в условиях клиники без использования жидкого азота. Контролем являлся
криоэкстракт плаценты сразу после отогрева на водяной бане при t +37єС,
приготовленный в соответствии с методикой получения препарата «Криоцелл -
криоэкстракт плаценты».
Статистическая обработка материала проведена общепринятыми методами по t
критерию Стьюдента-Фишера.
2.2. Методы исследования лабораторных животных
Работа выполнена на 28 старых (более 2-х лет) самках крыс линии Аугуста (для
более точной оценки действия препарата были нужны крупные 2-х цветные крысы)
массой 180-200г и 7 молодых (до 1 года) крысах массой 200-220 г.
Животные были разделены на 5 экспериментальных групп:
І группа – молодые интактные животные(n=7);
ІІ группа интактных старых животных служила контролем (n=7);
ІІІ группу составляли старые крысы, которым в течение 5-ти дней 1 раз в сутки
внутримышечно вводили криоэкстракт плаценты из расчета 0,1 мл на 100 г массы
животного (n=7) [156]
ІV группу составляли старые животные, которым под местной новокаиновой
анестезией в области бедра была произведена подкожная подсадка фрагмента
криоконсервированной плаценты, заготовленной в соответствии с методическими
рекомендациями получения этого препарата (n=7);
V группа состояла из животных, которым под эфирным наркозом была произведена
лапаротомия с двухсторонней аднексэктомией. Через 21 сутки после кастрации
животным так же, как и крысам ІІІ группы, вводили криоэкстракт плаценты (КЭПл)
по аналогичной методике(n=7);
Перед началом эксперимента ежедневно в течение недели у II-V групп животных для
контроля эстрального цикла брали из влагалища мазки с последующим нанесением их
на стекло и окраской метиленовой синью [7, 10]. После эксперимента у животных
этих групп опять брались вагинальные мазки.
Через 4 недели после опыта животных выводили из эксперимента посредством
декапитации.
Кровь из шейной вены исследовали на содержание гормонов – эстрадиола,
прогестерона и 11-ОКС. Гормоны определяли методом твердофазного
иммуноферментного анализа с использованием готовой тест-системы «Алькор-био»
[66, 109, 122].
Для гистологического исследования брали костную ткань (бедренную кость), а
также ткани надпочечников, щитовидной железы, яичников и матки, так как именно
в этих органах особенно выражены иволютивные изменения в старческом возрасте.
Морфологическое изучение тканей вышеперечисленных групп животных проводилось с
помощью гистологических методов. Взятые на исследование участки органов
фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине с последующей заливкой в парафин.
Для изучения костной ткани выделяли бедренную кость. С целью удаления
минеральных компонентов сразу после фиксации в 10%-ном формалине ее помещали в
декальцинирующий раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). После
декальцинирования исследуемый образец кости подвергали обезвоживанию в спиртах
возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин.
Полученные из парафиновых блоков срезы толщиной 6-8 микрон окрашивали
гематоксилином и эозином для получения обзорных гистологических
препаратов.[25,102].
Вся работа с животными проводилась в соответствии с положениями IV Европейской
Конвенции (ETS 123, 1986) по защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других научных целей. Животных содержали в стандартных
условиях вивария в течение 2 месяцев. Во время эксперимента проводили
визуальное наблюдение за самочувствием животных..
Статистическу
- Київ+380960830922