РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Биологический материал. Эксперименты проводились in vivo на 12 и 24-х месячных крысах линии Вистар массой 250-350 г. Белых крыс наиболее часто используют при исследовании влияния различных температурных воздействий, так как они являются объектами с хорошо выраженными терморегуляторными реакциями [145]. Это короткоживущий вид, у которого в норме при естественном старении артериальное давление существенно не изменяется, что позволило выбрать "более чистую" модель гипертонии.
На разных этапах эксперимента брали пробы тканей для биохимических, иммунологических и радиоизотопных исследований.
Модель гипертонии. В эксперименте артериальная гипертония обычно моделируется нарушением того или иного звена регуляторных процессов: "рефлексогенная гипертония", "почечная гипертония", "питуитриновая гипертония", но при развитии любой формы неминуемые нарушения развиваются, в конце концов, во всех звеньях нервно-гуморальной регуляции [53].
Мы выбрали и использовали рефлексогенную модель (эмоционально-болевой стресс [47, 50], усиленный периодической иммобилизацией). Группе животных наносили болевые раздражения электрическим током (15 с - воздействие, 45 с - перерыв) в течение 30 мин в каждый из 20 дней. Для этих целей использовали освещенную камеру, к полу которой был подведен электрический ток, замыкание контактов для его подачи производили в случайном режиме. Порог чувствительности определяли для каждого животного индивидуально, при этом напряжение не превышало 50 В. Периодически крыс помещали в пластиковые контейнеры, существенно ограничивающие движения, для регистрации АД, ЭКГ, ЭЭГ и потенциации стрессовых реакций. При этой модели артериальное давление у взрослых повышается больше, чем у старых животных (при почечной и питуитриновой - обратные соотношения), т.е. "наиболее чисто" можно оценить протектирующее действие гипотермии.
Гипертензию контролировали по стабильно высокому, по сравнению с интактными животными, АД, которое регистрировали непрямым методом по принципу медицинской тонометрии, c использованием специальных прижимных манжеток и датчиков пульса кровеносных сосудов хвоста животного [291]. Следует отметить, что измерялся средний или систолический уровень АД (особенности неинвазивной методики на крысах). Однако большинство исследователей считает, что с возрастом повышается в основном систолический уровень АД, тогда как диастолический изменяется незначительно.
Гипотермические воздействия. Охлаждение проводили на оригинальной установке, состоящей из электрогенератора и электроэнцефалографа, подключенных к планшетному потенциометру, у которого каретка с пером была заменена шторкой для прерывания потока холодного воздуха (~ 4-60C), подаваемого от промышленного гипотерма в камеры с животными при частоте воздействия 0,05-0,2 Гц (ритмическая гипотермия) [116, 117, 202].
В нескольких сериях экспериментов использовался непрерывный режим подачи хладагента с преимущественным охлаждением головы животного (краниоцеребральная гипотермия) [9, 116].
Время воздействия не превышало 90 мин, ректальная температура не опускалась ниже 340С.
Стереотаксический метод. Стереотаксический метод (греч. - stereos - твердый, объемный, пространственный + taxis - расположение) - метод хирургического воздействия на глубоко расположенные структуры мозга с использованием внутримозговых и черепных (экстракраниальных) ориентиров. В экспериментальных исследованиях практически все стимуляции, разрушения и введения веществ в глубоко расположенные структуры мозга осуществляются в настоящее время с помощью стереотаксического метода. При определении координат структур мозга используются два подхода: определение координат относительно экстракраниальных ориентиров - наружные слуховые проходы, края глазных орбит, сагитальная плоскость и т.д., и координат относительно внутримозговых ориентиров, выявляемых рентгенологически - передняя и задняя комиссуры, желудочки мозга, турецкое седло и т.д.
В основе использования экстракраниальных ориентиров лежит кранио-церебральная топография. Очевидные удобства этого метода ограничены недостаточной точностью, в связи с индивидуальной вариабельностью строения мозга. Поэтому в клинике краниальные ориентиры служат преимущественно для выбора доступа к необходимым структурам мозга и применяются как основные только в экспериментальных исследованиях на животных [40, 43, 60], но и в этом случае желательно использовать специальные поправки.
Стереотаксические приборы разработаны для каждого вида животных, отличия в их конструкции определяются особенностями строения головы животного. Для проведения стереотаксических операций на крысах мы использовали специальный прибор - СЭЖ-3.
Через 15-20 минут после введения в наркоз голова крысы жестко фиксировалась в двух точках - ушные проходы и верхняя челюсть. Это крепление является достаточным в связи с саблеобразной формой верхних резцов у данного вида животных, что не позволяет смещаться носовой части черепа вверх. При этом брегма оказывалась самой высокой точкой черепа. Операционное поле тщательно выстригалось и смазывалось раствором йода или спиртом. Местная анестезия производилась 0,5% раствором новокаина .Затем ножницами с загнутыми концами браншей вырезался лоскут кожи , отслаивались височные мышцы ,так чтобы не повредить надкостницу. Производилась разметка трепанационных отверстий для доступа к мозгу. Экстракраниальными ориентирами служили брегма, лямбда, срединная линия черепа. Электроды, канюли и др. вводились в определенные структуры мозга без прямого визуального контроля, по координатам [40, 43, 60]. Использовали индивидуальные поправки, связанные с возрастными различиями соответствия расположения внешних ориентиров на черепе структурам мозга [40, 60]. По окончании экспериментов проводился морфологический контроль локализации push-pull канюли и регистрирующих электродов.
Методики регистрации и анализа ЭКГ и ЭЭГ.
Электро