РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для виконання поставлених завдань дисертаційна робота виконувалась у 2 етапи, перший з яких полягає у роботі з статистичними матеріалами, тобто історіями пологів, а другий виключає власне клінічні та лабораторні дослідження, розробку та апробацію методик лікування.
2.1. Ретроспективний аналіз історій пологів
На першому етапі роботи проаналізовано перебіг вагітності та пологів у 260 вагітних з внутрішньоутробним інфікуванням плода, які перебували на стаціонарному лікуванні у Рівненському міському пологовому будинку №1, у зв'язку з ускладненнями перебігу вагітності, з 1997 по 2001 рр. Завданням цього дослідження було проаналізувати найдоступніші показники стану перебігу вагітності, частоту виявлення хламідіозу у вагітних з внутрішньоутробним інфікуванням, а також спостереження за динамікою його змін по роках. Це дало можливість розробити більш ефективні методи, спрямовані на профілактику та лікування внутрішньоутробного інфікування плода хламідіями.
2.2. Методи клінічних досліджень
Клінічне обстеження вагітних здійснювалось на базі Рівненського міського пологового будинку №1 та лікувально-діагностичного центру м. Рівне.
У дослідження було включено 143 вагітних жінки, серед яких 113 з верифікованою хламідійною інфекцією, 30 жінок - здорові, що склали контрольну групу. Термін вагітності становив 20-36 тижнів. Залежно від методу лікування хламідійної інфекції вагітні були поділені на 3 групи.
Перша (35 жін.) - отримувала вільпрафен по 500 мг 2 рази на добу протягом 10 днів;
Друга (38 жін.) - отримувала вільпрафен по 500 мг 2 рази на добу протягом 10 днів і препарат системної ензимотерапії "Вобензим" по 3 табл. 3 рази на добу протягом 15 днів;
Третя (40 жін.) - отримувала вільпрафен по 500 мг 2 рази на добу протягом 10 днів, препарат системної ензимотерапії "Вобензим" по 3 табл. 3 рази на добу протягом 15 днів та гомеопатичний препарат "Ехінацея композитум" по 2,2 мл внутрішньом'язово 2 рази на тиждень, усього 5 ін'єкцій.
У динаміці до та після лікування вивчали показники стану імунної системи, перекисного окиснення ліпідів та антиоксидантної системи захисту, ендогенної інтоксикації.
2.3. Лабораторні та інструментальні дослідження
2.3.1. Дослідження показників імунної системи
Вивчали такі показники імунної системи - кількість Т- (CD3) та В-лімфоцитів (CD72), субпопуляції Т-клітин (Т-хелпери (CD4), Т-кілери-супресори (СD8), T-NK-клітини (CD16)). Для їх визначення використовували реакцію непрямої поверхневої імунофлуоресценції з допомогою моноклональних антитіл МКА (Московський Інститут клінічної імунології).
Також визначали концентрацію імуноглобулінів Ig G, Ig M, Ig A в периферичній крові за методом Manchini et al. (1969).
Лімфоцити виділяли методом Бейюма. На 3 мл фікол-верографінової суміші з питомою масою 1,076 кг/дм3 нашаровували 10 мл гепаринізованої крові, попередньо розведеної середовищем Хенкса, центрифугували протягом 40 хв з частотою обертання 1500 об./хв. Зняту інтерфазу з лімфоцитами ресуспензували в середовище Хенкса, тричі центрифугували протягом 5 хв при 1500 об./хв, відмивання повторювали тричі. В камері Горяєва підраховували кількість клітин в 1 мл.
У лунки парафінової плівки на предметному склі вносили по 50 мкл лімфоцитів (суспензія повинна містити 2 млн клітин в 1 мл), інкубували в термостаті протягом 30 хв. На мазок клітин в лунках нашаровували моноклональні антитіла, інкубували протягом 30 хв в термостаті, відмивали в 5 порціях середовища Хенкса (по 1 хв в кожній порції). В лунки вносили мічену сироватку по 5 мкл в кожну і ставили на лід на 30 хв. Після відмивання в середовищі Хенкса в лунки додавали розчин гліцерину і накривали покривними скельцями. Клітини рахували з допомогою люмінесцентного мікроскопа "Люмам-1".
2.3.2. Оцінка активності процесів ліпопероксидації
Метод визначення дієнової кон'югації ненасичених вищих жирних кислот. Принцип методу грунтується на тому, що у процесі переокиснення ліпідів в молекулах субстратів, які окиснюються, утворюються споріднені подвійні зв'язки. При цьому з'являється максимум у спектрі поглинання оптичного випромінювання при довжині хвилі 233 нм.
У центрифужні пробірки наливали по 1 мл плазми чи 10 % гомогенату і 9 мл екстрагуючої суміші гептану з ізопропіловим спиртом у співвідношенні 1:1. Отриману суспензію центрифугували 10 хв при 4000 об./хв. Надосадову рідину зливали і додавали дистильованої води у співвідношенні 1:10, струшували і відсмоктували гептанову фазу в об'ємі 0,5 мл. Після цього додавали етиловий спирт в об'ємному співвідношенні 1:5 і визначали оптичну щільність при довжині хвилі 233 нм. В якості контролю використовували фосфатний буфер (рН=7,6). Концентрацію дієнових кон'югат розраховували, виходячи із коефіцієнта молярної екстинкції, що дорівнює 2,2 ·10-3 моль-1 · м-1.
Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ). Вміст ГПЛ визначали за методом В.Б. Гаврилова, М.И. Мишкорудной [393], який ґрунтується на тому, що екстраговані гептан-ізопропіловою сумішшю гідропероксиди мають відповідний максимум поглинання при довжині хвиль ?= 233 нм.
До 0,2 мл плазми або 10 % гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу (1:1) і струшували 15 хв на лабораторному струшувачі АВ-30. Потім у пробірки додавали по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвиль ?=232 нм. Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ проводили у відносних одиницях за формулою:
С= 10?Е?V1/V2 , (2.1)
де Е - оптична щільність гептанового шару проби;
V1 - кін