РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти, етапи та умови проведення експерименту
Досліди проводились на статевозрілих морських свинках-самцях, масою 380-400 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію, у зимову пору року.
Всі експериментальні тварини були поділені на 6 груп:
І група - інтактні тварини, які отримували розчин плацебо і служили вихідним контролем для тварин з гострою сироватковою хворобою (20 тварин);
ІІ група - інтактні тварини, які отримували розчин корвітину (20 тварин);
ІІІ група - інтактні тварини, які отримували розчин тіотріазоліну (20 тварин);
IV група - тварини з викликаною гострою сироватковою хворобою (20 тварин);
V група - тварини з викликаною гострою сироватковою хворобою, які отримували розчин корвітину (20 тварин);
VI група - тварини з викликаною гострою сироватковою хворобою, які отримували розчин тіотріазоліну (20 тварин);
Для відтворення гострого імунокомплексного процесу ми обрали модель гострої сироваткової хвороби, яку запропонували Dixon F.J., Feldman I.D., Vasquez J.J. [231], яка викликається одноразовим введенням у гомілкову вену задньої лапи морської свинки великої дози бичачого сироваткового альбуміну (БСА) з розрахунку 500 мг/кг маси. Лабораторними критеріями гострої сироваткової хвороби було збільшення вмісту в сироватці крові циркулюючих імунних комплексів малих і середніх розмірів.
Обидва середники (корвітин і тіотріазолін) вводилися доочеревинно 1 раз на добу, протягом 10 днів: корвітин вводився у разовій дозі 40 мг/кг (1 мл 0,4% розчину для тварин масою 100 г) [93], а тіотріазолін - у разовій дозі 50 мг/кг (0,2 мл 2,5% розчину для тварин масою 100 г) [132]. Першу ін'єкцію препаратів вводили одночасно з ін'єкцією бичачого сироваткового альбуміну.
Досліди на тваринах виконувалися з дотриманням ухвали Першого національного конгресу з біоетики про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей (Київ, 2001). Забір матеріалу проводили після декапітації тварин.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Методика визначення циркулюючих імунних комплексів. Кількісне визначення циркулюючих імунних комплексів проводили за допомогою ПЕГІКЕМ-тесту, Haskova V., Kaslik J., Math J., Matejckova M. (1977) [239], заснованого на преципітації ЦІК при невеликих концентраціях поліетиленгліколю (молекулярна маса - 6000). Поліетиленгліколь (ПЕГ) сприяє неспецифічній агрегації ЦІК, створюючи сприятливе для преципітації середовище. Враховуючи, що при застосуванні ПЕГ низької концентрації (2-3 %) преципітують лише великі ЦІК, а при концентрації 6-8 % преципітують ЦІК великих і малих розмірів. Ми використали три концентрації ПЕГ: 3,5 % - для преципітації великих ЦІК, 5,25 % - для преципітації великих і середніх ЦІК, 7 % - для преципітації великих, середніх і малих ЦІК. Оптичну щільність зразків вимірювали на спектрофотометрі СФ-56А в кюветах 1?1 при довжині хвилі 450 нм. Відповідь виражали в одиницях оптичної щільності.
2.2.2. Методика визначення гемолітичної активності комплементу. Ґрунтується на здатності комплементу сироватки викликати гемоліз сенсибілізованих баранячих еритроцитів в присутності сироватки кролика імунізованого баранячими еритроцитами (гемолітична сироватка) [19]. Змішування гемолітичної сироватки з еритроцитами проводять якомога скоріше, гемолітичну сироватку додають до завису еритроцитів, а не навпаки. Суміш витримують при Т 37?С 30 хв. для сенсибілізації еритроцитів. Залежність між кількістю комплементу та числом лізованих еритроцитів барана має лінійний характер в інтервалі 25-75%-го гемолізу. Тому, точне кількісне визначення гемолітичної активності комплементу повинно проводитися саме в цьому інтервалі. Активність комплементу визначають в гемолітичних одиницях. За одну 50% гемолітичну одиницю комплементу (СН50) беруть таку його кількість, яка викликає гемоліз 50% 1 мл стандартної суспензії сенсибілізованих еритроцитів при 37?С за 1 год.
2.2.3. Методика визначення активності креатинкінази у сироватці крові. Ґрунтується на здатності креатинкінази каталізувати перетворення креатину на креатинфосфат та його дисоціації [77]. Активність ферменту пропорційна кількості неорганічного фосфору, який утворюється у результаті кислотного гідролізу синтезованого ферментом креатинфосфату. Неорганічний фосфор визначають за кольоровою реакцією з молібдатом амонію. Оптичну щільність проб вимірювали на колориметрі фотоелектричному концентраційному КФК-2. Екстинцію дослідної проби порівняно з контрольною вимірюють при довжині хвилі 600-700 нм. Розрахунок здійснюють за калібрувальним графіком. З кожного стандартного розчину беруть по 0,4 мл і обробляють, як дослідні проби. У контрольну пробу замість стандартних розчинів добавляють по 0,4 мл води.
2.2.4. Методика визначення активності аспартатамінотрансферази у сироватці крові. Ґрунтується на здатності ферменту аспартатамінотрансферази каталізувати перенесення аміногруп від ?-аміно- до кетокислот [77]. Як кофермент у цій реакції використовують піридоксальфосфат. Внаслідок переамінування, яке відбувається під дією аспартатамінотрансферази, утворюються щавлевооцтова і піровиноградна кислоти. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюються забарвлені гідразони піровиноградної кислоти. Екстинцію вимірювали на колориметрі фотоелектричному концентраційному КФК-2 при довжині хвилі 500-560 нм у кюветі з товщиною шару 1 см порівняно з контрольною пробою. Контрольна проба ставилася аналогічно, як дослідна, але сироватку додавали після інкубації.
2.2.5. Методика визначення активності лактатдегідрогенази в сироватці крові. Методика ґрунтується на здатності ферменту лактатдегідрогенази каталізувати оборотну реакцію перетворення молочної кислоти на піровиноградну [77]. L-Лактат під дією ферменту сироватки при наявності НАД окислюється в піруват, який визначають за кольоровою реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином. Розрахунок активності здійснювався за калібрувальним графіком. З робочого стандартного
- Київ+380960830922