РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Нами було вивчено 100 біопсійних зразків ендометрія секреторної фази менструального циклу здорових жінок-донорів ооцитів, жінок з неплідністю нез'ясованого і запального генезу. Матеріал, що досліджувався, було розподілено на 3 групи:
І (контрольна група)- 20 біопсійних зразків ендометрія секреторної фази менструального цикла ( 19 - 22 ддень м/ц) здорових жінок репродуктивного віку, що приймали участь в програмах донації яйцеклітин, бактеріологічно та вірусологічно були перевірені (результати обстеження негативні). Кожна жінка мала щонайменше 1 генетично здорову дитину.
ІІ - 40 зразків ендометрія на 19 - 22 день м/ц секреторної фази менструального цикла жінок репродуктивного віку з неплідністю нез'ясованого генезу;
ІІІ - 40 біопсійних зразків ендометрія секреторної фази менструального цикла (19 - 22 день м/ц) жінок репродуктивного віку з неплідністю запального генезу (трубно - перитонеальний фактор).
Всім жінкам проводилася подвійна пайпель - біопсія ендометрія в лютеїновій фазі на ЛГ/П+6/7 та ЛГ/П+8/9 дні. Забір матеріалу для біопсії виконувався ендометріальним семплером (Wallace, UK) . Біопсійний матеріал ендометрія відмивався від крові у фізіологічному розчині та ділився на три частини для подальшого дослідження.
2.2. Методи дослідження
Для вирішення поставлених завдань у дослідженні були використані наступні методи:
1. Загальногістологічний метод проводили за стандартною схемою [58]. Фіксовану в нейтральному формаліні тканину ендометрія обробляли в парафіновій заливці, зрізи фарбували гематоксиліном та еозином, а також за Ван Гізон.
При фарбуванні за Ван Гізон вибіркове (але неспецифічне) забарвлення колагену пов'язане із його спорідненістю до кислих барвників у кислому середовищі (рН 1.0 - 2.0). Зв'язування барвника не є результатом іонної взаємодії. Приєднання кислого фуксину до гідроксильних груп деяких амінокислот колагену відбувається завдяки водневим зв'язкам між ними й аміногрупами барвників. Можлива також адсорбція барвника за рахунок гідрофобних зв'язків та сил Вандер - Ваальса.
2. Імуногістохімічні методи:
а) непрямий стрептавидін - пероксидазний метод виявлення експресії рецепторів до естрогенів (клон 1D5,DАКО).
Протокол забарвлення: блокування ендогенною пероксидазою, обробка предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1% розчину BSA, промивка в PBS - буфері, нанесення первинних антитіл до антигену естрогену (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Промивають в PBS - буфері і наносять вторинні антитіла. Промивка в PBS - буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавидін - пероксидази та інкубація на протязі 30 хв, промивка і нанесення АЕС - інкубація від 5 до 20 хвилин, до появи червоно - коричньового забарвлення з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра або метиленовим зеленим.
б) непрямий стрептавидін - пероксидазний метод виявлення експресії рецепторів до прогестерону (клон 1А6,DАКО).
Протокол забарвлення: блокування ендогенною пероксидазою або 3 - процентним розчином пероксида водню, обробка предметного скла водою, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1- процентним BSA, промивка в PBS - буфері, нанесення первинних антитіл до антигену прогестерону (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Промивають в PBS - буфері і наносять вторинні антитіла. Промивка в PBS - буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавидін - пероксидази та інкубація на протязі 30 хв., промивка і нанесення АЕС - інкубація від 5 до 20 хвилин, до появи червоно - коричньового забарвлення з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра або метиленовим зеленим. Далі пофарбовані зрізи заключали у напівштучне середовище Permanent Mounting Medium ( "DAKO").
Розповсюдженість та інтенсивність реакції оцінювали напівкількісним методом в балах, від 0 до 3:
1 ) розповсюдженість (PP):
0 - немає забарвлення;
1 - менше 10% позитивно забарвлених клітин;
2 - більше 10% і менше 50% позитивно забарвлених клітин;
3- гомогенне забарвлення 51%-80% клітин;
4-більш ніж 81% позитивно забарвлених ядер
2) оптична інтенсивність реакції (SI):
1) 0 балів - немає видимого забарвлення;
2) 1 бал - слабке забарвлення;
3) 2 бали - помірне забарвлення;
4) 3 бали - виразне забарвлення.
3. Метод скануючої електронної мікроскопії.
1) Матеріал відмивався від крові у фізіологічному розчині та фіксувався у 1,25% розчині глутарового альдегіда на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4) та дегідратувався розчином ацетону на дистильованій воді у зростаючих концентраціях (від 60 до 100%) - по 10 хвилин в кожній порції. В 100% ацетоні матеріал до наступного етапу зберігався в морозильній камері при - 20? С.
2) Висушування за допомогою метода переходу критичної точки відбувалося на базі Інституту біохімії НАН України. Сутність цього методу полягає в тому, що біологічний об'єкт, що був розташований у замкненій камері та знаходився в середовищі зрідженого газу, підлягає
під тиском нагріванню до температури вище критичної для даного середовища. При цьому відбувається його перехід до газоподібного стану, який не затримується дією поверхневого натягу. Висушування за допомогою цього методу відбувалось у спеціальному приладі .
Зразки ендометрію, що знаходились у 100% ацетоні витягали піпеткою з пробірок та переносили в спеціальні патрони, які вносили у попередньо охолоджену камеру, куди потім впускали зріджений вуглекислий газ з балону. Надходячи під тиском біля 6?106 Па до охолодженої камери, вуглекислий газ частково починає випаровуватись. Для того, щоб позбавитись від домішків ацетону в камері, кілька разів проводять "вмпускання" через випускний клапан. Після видалення залишків ацетону камеру наповнюють зрідженим вуглекислим газом з таким розрахунком, щоб рідина повністю покривала патрони із матеріалом. Впускни