РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Використані cполуки і реактиви
Дослідження були проведені з використанням протопорфірину ІX і геміну (ФС, що
належать до першого покоління), похідних хлоринів (фенільних і метилхінолінових
мезо-заміщених похідних, що є представниками другого покоління ФС), симетрично
заміщених похідних 4-N-метилпіридил-, метилхінолінил-, фенілпорфіринів, деяких
синтетичних несиметричних похідних, а також їх металокомплексів, отриманих у
ПНДЛ-5 Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. Повні назви
і схематичні формули вивчених сполук представлені на рисунку 2.1 та у таблиці
2.1. Методи синтезу, докази хімічної структури сполук фізико - хімічними
методами (УФ-, ІЧ-, ЯМР-спектроскопії, мас-спектрометрії) були викладені в
роботах [13, 16].
Рис. 2.1. Схематичні формули досліджуємих фотосенсибілізаторів
Таблиця 2.1
Повні назви та формули порфіринів
№ п/п
Порфірин
2
2
Протопорфірин IX
М
II*
мезо-Тетрафенілхлорин
Н
III*
мезо-Тетра(N-метил-6-хінолінил)хлорин
Н
М/Х
М/Х
М/Х
М/Х
IV
мезо-Тетрафенілпорфірин
Н
мезо-Тетра(4-N-метилпіридил)порфірин
йодид
Н
М/П
М/П
М/П
М/П
VI
мезо-Тетра(4-N-метил-піридил)порфірин тозилат
Н
М/П
М/П
М/П
М/П
VII
мезо-Тетра(N-метил-6-хінолінил)порфірин
Н
М/Х
М/Х
М/Х
М/Х
VIII
5,10,15-три(4-N-метил-піридил)-20-н-ноніл-порфірин тозилат
Н
М/П
М/П
М/П
С9Н19
IX
5,10,15-три(4-N-метил-піридил)-20-н-гексадецилпорфірин тозилат
Н
М/П
М/П
М/П
С16Н33
Примітка: Н – водень; М – метил-; Ф – феніл-; В – вініл-; П – залишок
пропіоновой кислоти; М/Х - N-метил-6-хінолінил- ; М/П -
4-N-метилпіридил-радикал.
* Похідні хлоринів (рис. 2.1).
Металокомплекси були представлені сполуками, які містили в координаційному
центрі d- (Fe, Zn, Ni) або p- (Ge, Sn) елементи (табл. 2.2).
Речовини використовувались в концентраціях 0.01-10 мкМ, вибір яких був
обумовлений раніше проведеними дослідженнями [31, 39]. Відповідні концентрації
препаратів готувалися розчиненням їх у дистильованій воді, після чого
автоклавувалися при 1 атм. і до експерименту зберігалися при 50С.
Таблиця 2.2
Металокомплекси фотосенсибілізаторів
Основа
Центральний атом
d-елемент
p-елемент
Fe
II
Ge, Sn
III
Sn
IV
Fe, Zn
Ge, Sn
Zn, Ni
Sn
VI
Fe, Zn, Ni
Ge, Sn
VII
Zn
Ge, Sn
VIII
Zn
IX
Zn
Речовиною порівняння при вивченні концентрацій досліджуваних похідних, які
інгібували розвиток 50 % клітин тест-культур (ІК50), був Photofrin®. Даний
препарат, який представляє собою комплекс порфіринових олігомерів, - перший ФС,
що був впроваджений у клінічну практику ФДТ. Визначення ІК50 проводили за
методом Спірмена-Кербера [26].
У ході науково-дослідних робіт також використовувалися: твін-80, тритон Х-100
фірми "Berak" (Berlіn), реактиви вітчизняного виробництва "Реахім" марки ч. д.
а. та о. с. ч. "Sіgma" (Сент-Луіс, США). Вимір оптичної щільності проводився за
допомогою спектрофотометрів Specord M-40 UV/VІS і Perkіn-Elmer Lambda 9
UV/VІS/IR.
2.2. Характеристика дріжджових культур та інших тест-об’ектів для дослідження
активності порфірінів
На першому етапі добору потенційних ФС оцінюють їх фотодинамічну і темнову
токсичність. У зв'язку з широким діапазоном активності сполук, які тестуються,
доцільним є проведення скринінга на декількох культурах, що розрізняються
чутливістю до відповідного впливу.
Експерементальні тест-моделі були розроблені на основі діплоїдних штамів
дріжджів C.albіcans ATCC 18804, S.cerevіsіae УКМ Y 497 і R.bogorіensіs ATCC
18809, з відомою чутливістю до антибіотиків, отримані з музею культур кафедри
мікробіології і вірусології ОНУ імені І. І. Мечникова, та полірезистентні до
антибіотиків клінічні штами C.albіcans, R.bogorіensіs і S.cerevіsіae, виділені
співробітниками кліничної лабораторії Одеської обласної клінічної лікарні.
Всього було використано 29 штамів: 23 штамів C.albіcans, та по 3 штама
R.bogorіensіs і S.cerevіsіae. Морфологічні та культуральні властивості
тест-штамів вивчали стандартними методами. Збереження тест-культур
здійснювалося за стандартною схемою [25]. Основні характеристики даних видів
дріжджів представлені в таблиці 2.3 [17, 25].
Таблиця 2.3
Характеристика дріжджів C.albicans, S.cerevisiae та R.bogoriensis
Ознака
Стан даної ознаки
C.albicans
S.cerevisiae
R.bogoriensis
Форма клітин
Круглі, овальні, подовжені
Круглі, овальні, подовжені
Круглі, овальні, подовжені
Розмір клітин, мкм
2.0-7.0 – 3.0-8.5
3.0-10.0 – 4.5-21.0
2.5-6.5 – 6.5-14.0
Вегетативні клітини
Утворення капсули
Псевдогіфи
Каротиноїдні пігменти
Асиміляція
глюкози
лактози
мальтози
сахарози
Уреазна активність
Ферментація
Рост при 37 0С
Примітка: +/- - наявність/відсутність ознаки; в - ознака варіює; д - клітини
диплоїдні.
C.albicans відносять до плівчатих неспороутворюючих дріжджів. Морфологія клітин
залежить від місця розвитку дріжджів. Клітини плівки більш подовжені, ніж
клітини осаду. Дані дріжджі розмножуються шляхом багатобічного брунькування, не
утворюють спор. Клітини при брунькуванні часто не відокремлюються, утворюючи
характерні колотівки.
Клітини S.cerevіsіae різної форми, частіше округлої, овальної або еліптичної,
розмноження вегетативне, брунькуванням. Вегетативне покоління дріжджів цього
роду в звичайних для них умовах