Ви є тут

Роль глікозаміноглікан-зв'язуючих білків у морфогенезі та пластичності мозку

Автор: 
Ушакова Галина Олександрівна
Тип роботи: 
Дис. докт. наук
Рік: 
2005
Артикул:
3505U000375
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Матеріали
Біологічні об’єкти. Модельні експерименти проводились на лабораторних щурах
лінії Вістар та білих нелінійних щурах, всього 342 тварини. Тварини знаходилися
у стандартних умовах із циклічністю доби: світло - 12 годин, ніч - 12 годин.
Головним об’єктом дослідження був головний мозок щурів та людини різного віку.
Також для досліджень використовувалися сироватка крові, селезінка, печінка,
тканини скелетних та серцевих м’язів щурів та людини. Декапітацію тварин
проводили під легким наркозом. Головний мозок очищали від оболонки та залишків
капілярів, інші тканини піддавали перфузії крижаним фізіологічним розчином. Усі
процедури проводили при +4оС. Кров відстоювали при +4оС протягом години та
центрифугували при 1500 об/хв. протягом 10 хв. Сироватку крові використовували
надалі для аналізу.
Для імунізації та отримання специфічних поліклональних антитіл використовували
4 дорослих кроля Шиншила.
Для дослідження глікозаміноглікан-зв’язуючих білків із різних тканин людини
використовувався аутопсийний матеріал головного мозку та тканин різних органів
від 24 жертв дорожно-транспорних катастроф, що був наданий обласною лікарнею
ім. Мечнікова м. Дніпропетровська. Головний мозок з абортивного матеріалу був
люб’язно наданий міською лікарнею №9 м. Дніпропетровська. Надання та
використання біологічного матеріалу людини проводилось згідно Хельсінкської
декларації прав людини.
Об’єктом дослідження морфогенезу нейронів була моношарова культура нейронів
гіпокампу щура.
Хімічні реагенти. В роботі використовувалися особливо чисті реагенти фірм Sigma
(USA), Fluka (Switzerland), Serva (Germany), Medix Biochemica (Finland),
Boehringer Mannheim Biochemica (Germany), Medac (Germany), Serotec (Germany),
DAKOPATS (Denmark), Affaniti (Nottingham, UK), Реагент (Дніпропетровськ,
Україна). Лабораторний пластик та концентруючи патрони були придбані у фірм
«Amicon» (USA) та «Nunc» (USA).
2.2. Отримання білкових фракцій з мозку
Для визначення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності
білків, що різняться за місцем локалізації, була обрана схема диференціального
фракціонування білків, що представлена на рис. 2.1.
Гомогенізацію тканини мозку проводили у скляному гомогенізаторі з тефлоновою
маточкою в буфері А, що містив трис – 0,25 мМ (рН7,4), ЕДТО – 1 мМ,
дитіотрейтол – 2 мМ, ФМСФ – 0,2 мМ, NaN3 – 3 мМ, у співвідношенні 1:10. У ході
послідовних стадій екстракції та центрифугування були видалені 4 фракції, що
містили 1 – водорозчинні білки цитозолю та міжклітинного матриксу; 2 –
мембраноасоційовані білки (білки, що локалізовані навколо плазматичної
мембрани, й асоційовані з мембраною за рахунок слабких електростатичних
взаємодій); 3 – мембранні (трансмембранні білки, що пронизують плазматичну
мембрану наскрізь) й 4 – екстрацелюлярні/цитоскелетні білки (філаментні білки
цитоскелету й ядерного скелету, та протеоглікани міжклітинного матриксу).
Для очистки гепарансульфат-зв’язуючих білків отримували фракцію
мембраноасоційованих білків із мозку новонароджених щурів. Використовували 90 г
тканини, яку гомогенізували у 10 об'ємах буфера, що містив трис – 0,05 М, рН
7,0, NaCl – 0,15 М, ЕДТО – 1 мМ, соєвий інгібітор трипсину – 1 мМ,
бета-меркаптоетанол – 2 мМ, ФМСФ – 1 мМ, мертиолят – 0,05%, лейпептин – 0,001%.
Після центрифугування при 50 000 g протягом 1 години відбирали супернатант, що
містив фракцію розчинних білків.
Гомогенізація тканини мозку в буфері А, що містив
трис – 0,25 мМ (рН7,4), ЕДТО – 1 мМ, дитіотрейтол – 2 мМ,
ФМСФ – 0,2 мМ, NaN3 – 3 мМ,
у співвідношенні 1:10. Інкубація протягом 1 години.
Центрифугування
50 000g, 60 хв. S1 – розчинна фракція білків
Р1+ буфер А (вимивання залишку
водорозчинних білків )
Р1+ буфер А, що містив NaCl – 2 М.
Інкубація – 2 год.
50 000g S2 – мембраноасоційована
60 хв. фракція білків
Р2+ буфер А (вимивання залишку
відповідних білків)
Р2 + буфер А, що містив тритон Х-100 – 2%.
Інкубація – 12 год.
100 000g S3 – мембранна
60 хв. фракція білків
Р3 + буфер А (вимивання залишку
відповідних білків)

Р3 + буфер А, що містив сечовину – 4 М.
Інкубація – 12 год.
100 000g S4 – екстрацелюлярна/
60 хв. цитоскелетна фракція білків
Р4
Рис. 2.1. Схема диференціального фракціонування білків із тканини мозку. S –
супернатант (надосадовий розчин), P – осад.
Осад тричі промивали початковим буфером і ресуспендували в даному буфері, що
додатково містив NaCl із кінцевою концентрацією – 2 М, інкубацію проводили 2
години. Після центрифугування відбирали супернатант, який використовували для
подальших етапів очищення гепарансульфат-зв'язуючих мембраноасоційованих
білків.
Для очистки мембранних гіалуронат-зв’язуючих білків із мозку ембріонів людини
була отримана мембранна фракція білків, яка подалі використовувалася для
афінної хроматографії.
2.3. Визначення кількості глікозаміногліканів
Загальну кількість глікозаміногліканів оцінювали за оптичною густиною розчину,
що містив комплекс, утворений цими полісахаридами з барвником алціаном
блакитним. Важлива особливість цього барвника полягає в тому, що, залежно від
кислотності середовища, він вибірково утворює комплекси із сульфатованими
(кисле середовище) або несульфатованими (лужне середовище)
глікозаміногліканами. Ця особливість урахована у відповідних модифікаціях
методу Голда [299], які ми використовували у своїй роботі. Так, для забарвлення
сульфатованих глікозаміногліканів (гепарансульфата, кератансульфата,