РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Матеріалом для даного дослідження були серця трьох об’єктів: курей породи білий
леггорн, білих безпородних мишей та людини. Курячі яйця отримували з
птахофабрики №2 м.Дніпропетровська. Серця ембріонів курей отримували згідно
загально прийнятим методикам інкубації [51], при використанні таблиць
нормального розвитку ембріона курки за Hamburger і Hamilton. Білих безпородних
мишей отримували з віварію ДДМА і утримували в стандартних умовах.
Ембріональний матеріал експериментальних тварин отримували в лабораторних
умовах відповідно до рекомендацій, викладених у довідково-методичному посібнику
"Объекты биологии развития" [51] та у рекомендаціях [49], при використані
відповідних таблиць нормального розвитку.
Матеріал ембріонів і плодів людини отримували з пологових будинків м.
Дніпропетровська. Для визначення віку ембріонів і плодів проводили вимірювання
тім’яно-куприкової довжини (ТКД), згідно рекомендацій Л.І.Фаліна [80]. Усього
було досліджено 1300 об’єктів. Розподіл матеріалу різних об’єктів за стадіями
розвитку та термінами інкубації представлений у таблицях 2.1-2.3.
2.2. Методи дослідження
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний комплекс методів
анатомічного, гістологічного, гістохімічного, лектингістохімічного,
ультраструктурного, морфометричного і стереологічного аналізу, а також
просторова реконструкція та комп’ютерне тривимірне моделювання компонентів
серця вивчених об’єктів.
Інкубація. Яйця курей породи білий легорн інкубували при 38°С та за відносної
вологості 80%. Метою інкубації було отримання курячих ембріонів з фіксованими
термінами розвитку. Вибірка і стандартизація термінів розвитку ембріонів
здійснювалася за допомогою стандартних таблиць нормального розвитку за НН.
Таблиця 2.1
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку людини
Термін розвитку
Кількість об'єктів
Ембріональний період
4 тиждень
5 тиждень
20
6 тиждень
11
8 тиждень
Плодовий період
10 тиждень
Усього
45
Обробка курячих зародків етанолом. Для з'ясування можливих порушень у
формуванні серця курячих зародків використовували модель, яка поєднує вплив на
клітини нервового гребеня до початку їх міграції у серце та викликає спектр вад
серця, близький до того, що спостерігається після видалення нервового гребеня
[120]. Для цього 0,2-0,25 мл 50% етанолу на 72 годині інкубації [157] вводили у
повітряну камеру курячих яєць. При використанні цієї моделі концентрація
етанолу залишається високою в альбуміні курячого яйця протягом однієї доби
після введення та наближається до рівня, що спостерігається після алкогольної
інтоксикації у людини [119]. Для контролю в усіх моделях використовували
інтактних зародків, що, за даними літератури, не відрізняється від результатів
при використанні несправжньооперованих зародків [67, 97, 147].
Таблиця 2.2
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку курки
Термін інкубації
Кількість об’єктів у групі
норма
етанол
РК
29 годин
30 годин
34 годин
36 годин
38 годин
42 годин
48 годин
50 годин
53 годин
60 годин
3 доба
10
27
4 доба
10
30
32
5 доба
13
45
46
6 доба
12
47
48
8 доба
12
60
95
Усього
85
192
280
Обробка курячих зародків РК. Для з'ясування порушень у формуванні серця курячих
зародків після дії цього тератогену використовували 2 моделі з різним терміном
введення. Перша модель була обрана для з’ясування порушень у кардіогенезі при
дії РК до початку міграції нервового гребеня від місця первинного формування
біля нервової трубки. Для цього 0,5 мкг повного трансізомеру РК (Sigma Co, США)
у 0,01 мл 2 % розчину диметилсульфоксиду наносили безпосередньо на зародкову
ділянку [251]. Потім яйця запечатували та продовжували інкубацію. Внаслідок
високого рівня смертності зародків дослідження з використанням цієї моделі
проводили до 53 годин інкубації.
Таблиця 2.3
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку миші
Термін інкубації
Кількість об’єктів у групі
норма
етанол
РК
9 доба
43
42
46
10 доба
42
41
47
11 доба
45
47
42
12 доба
30
48
45
14 доба
33
65
82
Усього
193
243
262
У другій моделі було враховано три моменти: 1) введення РК здійснювали до
початку міграції клітин нервового гребеня у серце; 2) спектр очікуваних вад
наближався до тих, що найчастіше спостерігаються у новонароджених дітей та 3) в
експерименті на курячих зародках з видаленням нервового гребеня [233]. У цій
моделі 1 мкг РК у 0,01 мл 2% диметилсульфоксиду наносили на зародок на стадії
15 за НН [147]. Стадію визначали при інкубації до 56-57 годин при використанні
бінокулярного мікроскопа.
Обробка мишачих зародків етанолом. Введення тератогену проводили на 8,5 добі
вагітності. На цей строк клітини нервового гребеня залишаються у зябрових дугах
та не розпочинають мігрувати у серце [104]. 25% розчин етанолу вводився
вагітній самиці одноразово інтраперітонеально у дозі 0,03 мл/г ваги [133]. При
цьому тварини входили в алкогольну кому, яка тривала близько 20 хвилин.
Обробка мишачих зародків РК. Вагітним самицям одноразово інтраперітонеально
вводили РК у дозі 70 мг/г ваги самиці у 0,1 мл 2% діметилсульфоксиду на 8,5
добі вагітності [144].
Препарування. Метою цієї методики було одержання ембріонів на ранніх стадіях
розвитку й ізольованих сердець ембріонів курки на більш пізніх термінах
інкубації. Ембріони з терміном інкубації до 6 доби та мишачі зародки до 12 доби
пренатального розвитку фіксувалися повністю, а на всіх більш пізніх термінах
розвитку ембріони підля
- Київ+380960830922