РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Матеріалом для проведення досліджень служив 71 препарат яєчка і над'яєчка, забраних при некропсії чоловіків зрілого віку (22 - 35 років), 22 препарати яєчка і над'яєчка, забраних прижиттєво як післяопераційний матеріал (епідидимоорхіт і водянка яєчка), та 17 біоптатів яєчка безплідних чоловіків, в анамнезі яких перенесений епідидимоорхіт і водянка яєчка. Комісією з питань біоетики Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника (протокол № 3 від 04. 09. 2006р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено. Досліджуваний матеріал розподілено на такі групи: 1) яєчка і над'яєчка практично здорових чоловіків віком 22 - 35 років (контрольна група); 2) яєчка і над'яєчка чоловіків зрілого віку, в анамнезі яких було виявлено епідидимоорхіт; 3) яєчка і над'яєчка чоловіків зрілого віку, в анамнезі яких було виявлено водянку яєчка. Відомості про використані препарати подані у таблиці 2.1.
Також було проведено аналіз сперматограм 24 чоловіків, що звернулися в андрологічний кабінет у зв'язку з безплідністю, яка розвинулась після перенесеного епідидимоорхіту.
У експериментальній частині роботи на 74 статевозрілих (віком 8 місяців) білих лабораторних щурах-самцях лінії Вістар масою 180 - 250 г проведено дослідження паренхіми і мікроциркуляторного русла яєчка при експериментальному орхіті різного терміну тривалості. Тварин було розділено на 3 групи: 1) контрольна група; 2) група щурів після проколювання лівого яєчка стерильною інсуліновою голкою; 3) група щурів після ін'єкції під білкову оболонку лівого яєчка 0,1 мл культури Escherichia coli (із розведенням 1 млн. мікробних тіл в 1 мл), стерильною інсуліновою голкою. Маніпуляції проводили під загальним ефірним наркозом. Яєчка вивчали через 1, 7, 30 і 90 діб.
Таблиця 2.1
Розподіл досліджуваних препаратів яєчка і над'яєчка чоловіків зрілого віку
Досліджува-ні групи
Кількість випадківПредмет дослідження (кількість препаратів)Артерії і вениГемомікро-циркуляторне руслоЗвивисті сім'яні трубочки і протока
над'яєчкаУльтра-
структура звивистих сім'яних трубочокКонтрольна
група3720575Епідидимо-
орхіт3920586Водянка яєчка3416576Всього:11056152217
Догляд тварин та маніпуляції з ними проводили у відповідності до вимог Додатку 4 до "Правил проведення робіт з використанням експериментальних тварин", затверджених наказом Міністерства охорони здоров'я № 755 від 12.08.1997 р. "Про заходи щодо подальшого удосконалення організаційних форм роботи з використанням експериментальних тварин" та положень "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики" [Київ, 2001 р.]. Утримували тварин в умовах віварію, на звичному харчовому раціоні. Тварин дослідних і контрольної груп утримували в ідентичних умовах, а матеріал, взятий для дослідження, вивчали паралельно. Проколювання і інокуляцію яєчка проводили, намагаючись уникнути пошкодження кровоносних судин. Евтаназію тварин здійснювали шляхом передозуванням ефіру для наркозу і забирали сім'яники, відповідно до термінів проведення досліду. Відомості про тварин наведені у таблиці 2.2.
Таблиця 2.2
Розподіл тварин за характером проведених експериментів
Характер експеримен-тального втручанняТерміни забору яєчка (діб)Предмет
дослідженняКількість тварин
в групі№ тваринКонтрольна група1, 7, 30, 90 Звивисті сім'яні трубочки, гемомікро-циркуляторне русло101 - 10Прокол лівого яєчка голкою1, 7, 30, 90 Звивисті сім'яні трубочки, гемомікро-циркуляторне русло3211 - 42Ін'єкція лівого яєчка 0,1 мл культури E. coli1, 7, 30, 90 Звивисті сім'яні трубочки, гемомікро-циркуляторне русло3243 - 74Всього:74
У ході проведення досліджень секційного, біопсійного і експериментального матеріалу застосовано наступні методи:
1) роздільна ін'єкція артерій, вен і судин мікроциркуляторного русла;
2) ангіорентгенографія;
3) гістологічні дослідження елементів паренхіми яєчка і над'яєчка та їх морфометричний аналіз;
4) електронно-мікроскопічні дослідження структур яєчка;
5) лабораторні дослідження еякуляту чоловіків.
2.2. Приготування ін'єкційного матеріалу і виявлення Escherichia coli
в тканині ін'єкованого яєчка
Використаний штам культури Escherichia coli (з гемолітичними властивостями) був ізольований від пацієнта зі хронічним бактеріальним простатитом. Культура зберігалася в напіврідкому агарі, залитому вазеліновим маслом. Звідти було зроблено посів на скошений агар, який вирощувався в термостаті при температурі 370С, з наступним перенесенням і аналогічним вирощуванням культури на рідкому пептонному середовищі. Із нього отримували ін'єкційний матеріал шляхом розведення культури на фізіологічному розчині, відповідно до оптичного стандарту мутності. При заборі яєчка виявляли наявність Escherichia coli у його тканині. Для цього стерильною інсуліновою голкою робився посів із тканини яєчка на рідке пептонне середовище, яке витримували в термостаті 1 добу при температурі 370С. Із нього робили мазок на склі, який зафарбовували за Грамом або фуксином водним і вивчали під світловим мікроскопом, в імерсії при збільшенні 90х7, 90х15. Для перевірки робили посів на пластинчастий агар і середовище ЕНДО.
2.3. Роздільна ін'єкція артерій, вен і судин мікроциркуляторного
русла. Ангіорентгенографія
Для ін'єкції артерій та вен яєчка і над'яєчка використовували рентгенконтрастну речовину - завись тонко тертих свинцевих білил у рівних частинах ефіру і хлороформу. Перед вживанням суміш фільтрували, після чого інтенсивно змішували. Ін'єкцію артерій та вен проводили окремо, безпосередньо через яєчкову артерію чи вену, після чого виконували ангіорентгенографію.
Для наповнювання судин мікроциркуляторного русла яєчка і над'яєчка використовували завись паризької синьої (10 г фарби на 100 мл розчин