РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Тварини, органотипові культури гіпокампу та дисоційовані культури
нейронів гіпокампу нормальних та генетично модифікованих тварин
В експериментах використовували мишей тритижневого віку L1-дефіцитної (L1-/-) лінії, що були створена за допомогою контрольованого тетрацикліном трансактиватора, вбудованого у другий екзон гена L1 [369]. Цих тварин підтримували на генетичній основі 129SvJ/NMRI. Також досліджували самців мишей L1-/- лінії тримісячного віку, у яких інактивація гену L1 відбувалась починаючи з початку третьої декади постнатального розвитку. Ця лінія була отримана завдяки використанню двокомпонентної cre-loxP рекомбінаційної системи [253]. Для цього використовували тварин двох генетично модифікованих ліній: 1) химерну мишу, у якої один з екзонів гену L1 був з обох боків оточений LoxP-послідовностями, що є мішенями для cre-рекомбінази (L1-floxed миша); та 2) трансгенну мишу, у якої у постнатальному періоді у мозку спостерігається обмежена експресія cre-рекомбінази, що регулюється ?CAMKII промотором. Так як ген L1 локалізується у Х хромосомі, нащадки від зхрещування тварин двох вищезгаданих ліній - L1-floxed самці, що несуть ?CAMKII-cre трансген (L1fy+), характеризуються інактивацією гену L1. Також досліджували CHL1-дефіцитних (CHL1-/-) мишей 20-денного та однорічного віку [303]. У експериментах використовували дорослих NCAM-дефіцитних (NCAM-/-) самців миши [113]. CHL1-/- та NCAM-/- мишей підтримували на генетичній основі C57BL/6J. Досліджували самців тенасцін-R-дефіцитної (тенасцин-R-/-) лінії віком 10-, 20- та 80 діб [460]. Тенасцин-R-/- лінію мишей підтримували зхрещуванням гомозиготних тварин, що мали генетичну основу C57BL/6J. Дефіцит CHL1, NCAM, та тенасцину-R у лініях мишей, що досліджували, був створений завдяки селективній інактивації відповідних генів шляхом гомологічної рекомбінації у ембріональних стовбурових клітинах. У якості контроля для L1-/-, CHL1-/- та NCAM-/- мишей використовували мишей дикого типу з того ж самого припліду аналогічної статі. Контролем для тенасцин-R-/- тварин були гомозиготні тенасцин-R+/+ миши з аналогічною генетичною основою, подібної статі та віку. У експериментах з аналізу чутливості методів топографічного аналізу та комп'ютерного моделювання використовували дорослих самців щура, культивовані зрізи гіпокампу від щурів 7-денного віку, а також дисоційовані культури нейронів гіпокампу ембріонів безпорідних щурів. У експериментах з вивчення участі NCAM у механізмах організації постсинаптичного ущільнення культури нейронів гіпокампу отримували від мишей ліній C57BL/6J (контроль) та NCAM-/- 1-3-денного віку, яких отримували від гомозиготного зхрещування. Індивідуальні експериментальні та контрольні групи складались як мінімум з 5 тварин.
2.2. Культивування тканин та клітин in vitro
Зрізи гіпокампу 300 мкм завтовшки, отримані від щурів 7-денного віку, культивували in vitro на мембранах Millicell (Millipore, США) на межі між поживним середовищем та газовою фазою (повітря + 5% CO2) протягом 7 днів [423]. Поживне середовище містило МЕМ (Gibco, США) - 50%, сольовий розчін Хенкса - 25%, конячу сироватку (Sigma, США) - 25%, глюкозу - 6,5 мг/мл (pH7,2). Дісоційовані клітини гіпокампу були посажені на скельця, вкриті полі-L-лізіном, та вирощувались на протязі 12 днів у термостаті (5% СО2, 37оС) [10, 26, 29].
Культури нейронів гіпокампу вирощували на покривних скельцях у культуральному середовищі з доданням 5% конячої сироватки та гормонів (Sigma-Aldrich, США). Покривні скельця вкривали полі-L-лізіном та ламініном, занурюючи їх у розчин, що містив 100 мкг/мл полі-L-лізіну та 2 мкг/мл ламініну. Через 4 дні після початку культивування нейрони були трасфіковані відповідними ДНК-конструктами спектрину. В іншому випадку нейрони трансфікували siРНК спектрину з використанням ліпофектаміну 2000 (Invitrogen, США) через 12 днів культивування у відповідності до інструкцій виробника. В обох випадках нейрони аналізували через 14 днів після початку культивування.
2.3. Електронномікроскопічний аналіз клітин та синапсів гіпокампу
Тварини були анестезовані пентобарбіталом натрія (Narcoren(r)) у дозі 40 мг/кг (Rhone Merieux GmbH, Німеччина) та перфузовані транскардіально сумішю 2% формальдегіду та 2,5% глютаральдегіду на 0,1М фосфатному буфері (рН 7,4). Після перфузії головний мозок звільняли від оточуючих тканин та зберігали протягом ночі при +4оС у 4% формальдегіді та 5% глютаральдегіду на аналогічному буфері. На наступний день мозок заключали у агар та різали на вібратомі VT1000S (Leica Microsystems, Німеччина) на фронтальні зрізи товщиною 100 мкм. Зрізи тканини додатково фіксували протягом 1,5 години у 1% OsO4 на 0,1М какодилатному буфері (рН 7,4). Після цього тканину зневоднювали у серії метанолів зростаючої концентрації та занурювали у епон між двома аркушами пластику. Перед виготовленням тонких зрізів пласкі фрагменти тканини, що відповідали конкретним районам гіпокампу, вирізали з епону та приклеювали на епоновий блок за допомогою цианокрілатного клею Roti(r)-Coll1 (Carl Roth, Німеччина).
Культивувані зрізи гіпокампу фіксували у розчині 2% формальдегіду та 3% глютаральдегіду на 0,1М фосфатному буфері (рН 7,4) протягом однієї години, а потім у 1% розчині OsO4 на аналогічному буфері протягом однієї години при кімнатній температурі. Фіксовану тканину зневоднювали у серії етанолів зростаючої концентрації та заключали у епон-аралдіт. Ультра тонкі зрізи товщиною 70 нм робили за допомогою ультрамікротома Leica Ultracut S (Leica Microsystems, Німеччина). Зрізи збирали на мідні сіточки (300 mesh), контрастували цитратом свінцю та ацетатом ураніла та аналізували на мікроскопі EM10С (Zeiss, Німеччина), CEM902A (Zeiss, Німеччина) або JEM100CX (Jeol, Японія).
2.4. Стереологічний аналіз кількості нейронів, синапсів та активних зон
Кількість симетричних синапсів, сформованих на тілах пірамідних нейронів СА1 зони гіп