ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Эксперименты были проведены на нейронах дорзальной поверхности подглоточного комплекса ганглиев улитки Helix albescens Rosm.
Влияние различных химических соединений было изучено на 445 идентифицированных и неидентифицированных нейронах моллюска. На наличие синаптических связей с нейроном ППа1 и ППа2 протестировано по 128 клеток ВГ и 100 пар нейронов этого ганглия проверялись на присутствие синаптических контактов друг с другом. Также, под влиянием салицилатов, исследована активность 18 изолированных нейронов ППа1.
2.1. Методика внутриклеточного отведения биопотенциалов
После извлечения окологлоточного нервного кольца из тела улитки его фиксировали за нервы с помощью вольфрамовых игл в экспериментальной камере, дно которой было покрыто силиконовой резиной. Объем экспериментальной камеры составлял 0,5 мл. Наружные соединительнотканные оболочки ганглия удалялись механическим путем, без применения обработки ферментом. Это связано с тем, что фермент изменяет активность различных мембранных структур и функциональное состояние клетки. В результате чего, изменится их реакция на действие различных веществ и, следовательно, нарушится чистота эксперимента. Исследования проводились при температуре 18 - 210С, что также важно для получения адекватных результатов [78]. Стандартный раствор Рингера для беспозвоночных, которым омывалось окологлоточное нервное кольцо (скорость смены растворов - 20 - 25 мл/час), имел следующий ионный состав (в мМ): NaCl 100, KCl 4, CaCl2 10, MgCl2 4, ТРИС-HCl 10; рН 7,45. Изменения в составе раствора Рингера будут указаны при описании конкретных экспериментов. Все использованные в работе химические соединения растворялись и разводились стандартным раствором Рингера до нужных концентраций. Аппликация химических веществ выполнялась путем перфузии данного вещества в экспериментальную камеру и с помощью метода "фиксации концентрации" [121], который позволял быстро сменить внеклеточный раствор за 20 - 50 мс.
В работе применяли стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 10-30 МОм, заполненные 2.5 М раствором KCl.
2.2. Изоляция нейронов
При изоляции нейронов ППа1 сначала для точной их идентификации регистрировали фоновую электрическую активность, а затем извлекали микроэлектрод и перерезали коннективу между правым париетальным ганглием и висцеральным ганглием, куда направлены главные отростки клетки ППа1. Затем снова вводили микроэлектрод в клетку и, непрерывно регистрируя ее электрическую активность, с помощью микроманипулятора механически изолировали сому этого нейрона, извлекая ее из ганглия. Как правило, вместе с сомой извлекалась и часть аксодендритного дерева этой клетки.
2.3. Методика обнаружения синаптических связей между нейронами
Для выяснения синаптических взаимоотношений использовалось два микроэлектрода. Первый микроэлектрод, который имел выход к усилителю, использовался для отведения активности от нейронов. Второй с помощью изолирующего устройства был соединен со стимулятором ЭСУ-2 и через него производилась электрическая стимуляция различных клеток деполяризующим током надпороговой величины с частотой 1 Гц.
2.4. Регистрация данных и обработка результатов
При регистрации электрической активности в нейроны вводили по одному микроэлектроду, который был связан с входным предусилителем, соединенным с усилителем нейронной активности УФУ-БК. За электрической активностью нейронов наблюдали с экрана четырех лучевого осциллографа УФУ-БКН и с монитора компьютера. В качестве индифферентного электрода использовали электрод от стимулятора ЭСЛ-2 с диодным мостиком 1 Ом - 1 кОм. Через индиферентный электрод подавался калибровочный сигнал с амплитудой 75 мВ и длительностью 100 мс. Микроэлектроды были связаны с электрической частью установки через солевой мостик и Ag-AgCl электрод. Введение микроэлектродов в нейроны осуществляли под контролем микроскопа стереоскопического панкратического МСПЭ - 1 с оптоволоконным осветителем ОВС - 1.
Сигнал с выхода усилителя тока поступал на каскад усиления с измененным коэффициентом передачи (1-100), а далее - на однокаскадный активный фильтр низких частот с программируемой частотой среза (0.5; 1; 2 и 3 кГц). С выхода фильтра сигнал поступал на аналогово-цифровой преобразователь (АЦП), который через интерфейс прямого доступа был подключен к памяти персональной ЭВМ. Интерфейс прямого доступа к памяти управлялся с терминала компьютера. Режим функционирования каналов регистрации токов, частота, амплитуда и другие параметры контролировались компьютером. АЦП построен на базе 12 бит, 4-х канального конвертера ADS7841 с последовательным синхронным интерфейсом, программируемой точностью, понижаемой до 8 бит. Максимальная частота выборки - 200 кГц.
Помимо ADS7841 в устройстве использован микроконтроллер фирмы ATMEL, имеющий RISC-архитектуру, который осуществляет интерфейс с персонального компьютера (формирует и пересылает пакеты данных, настраивает АЦП на требуемый режим работы). Прецизионный источник питания фирмы Texas Instruments обеспечивал стабильную подачу опорного напряжения. Реализация АЦП в виде отдельного, выносного устройства, подключаемого к последовательному порту персонального компьютера, позволяла легко настраивать и использовать прибор на разных машинах.
Программное обеспечение персонального компьютера разработано в нашей лаборатории при помощи Sybase Watcom C++ v11.0 для операционной системы Windows (95, 98 2000 или NT). Программа позволяет производить непрерывную запись медленных и спайковых потенциалов в течение заданного времени, с возможностью последующего просмотра, масштабирования, разделения полученных данных на отдельные файлы. В программе предусмотрены следующие функции:
* выбор масштаба отображения полученного сигнала (по времени);
* подсчет разницы по времени и по амплитуде между двумя указанными выборками;
* пяти-полосный частотный Фурье-фильтр;
* получение