РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Джерела бактерій та фагів
У роботі використано музейні культури молочнокислих бактерій Технологічного
інституту нституту молока та м’яса УААН: Lactococcus lactis ssp. lactis – 26
штамів, L. lactis ssp. diacetilactis – 17 штамів, Lactococcus lactis ssp.
cremoris – 34 штами, Streptococcus salivarіus ssp. thermophilus – 68 штамів та
2 штами Enterococcus faecium.
Культури МКБ підтримували у стерильному знежиреному молоці, поновлюючи їх через
кожні 25–30 днів за оптимальної для кожного виду температури росту. Зберігали
за температури 6–8єС. Перед проведенням дослідів культури активізували шляхом
двократного пересіву в гідролізоване молоко (бульйон або ГМ), яке готували за
методикою, описаною Банниковою [3].
У дослідах використовували 4–5 годинні культури, що перебували в середині
логарифмічної фази росту.
Фаги виділяли зі зразків кисломолочної продукції підприємств молочного профілю
м. Києва, Київської, Сумської і Полтавської областей та сироватки і ропи з-під
сиру сирзаводу Черкаської області. Відбір дослідного матеріалу та виділення
фагів проводили у стерильних умовах. Досліджувані зразки центрифугували за
режиму 2 500 об/хв протягом 20 хв після чого надосадову рідину краплями
наносили на газони бактерій відповідних штамів. Бактеріальний газон готували
згідно з методикою приготування верхнього шару для титрування фагів методом
подвійного агару [1]. Про наявність фагів свідчила поява зон лізису чи окремих
негативних колоній у місці нанесення досліджуваного матеріалу через 18–24
інкубації за умов оптимальної для росту бактеріального штаму температури (для
мезофільних МКБ – 30єС, для термофільних МКБ – 37єС).
Для виявлення фагів у сироватці використовували метод збагачення. З цією метою
досліджуваний матеріал вносили у ГМ, інокульоване (1% від об’єму) відповідною
чутливою культурою. Суміш інкубували при температурі, сприятливій для росту
культури, після чого проводили дослідження щодо наявності фага, як описано
вище.
Виділення чистих ліній фагів здійснювали методом двошарового агару шляхом
послідовних пасажів фагів із морфологічно однотипних негативних колоній [18].
Для кожного ізоляту фага проводили шість послідовних пасажів.
Серійні розведення зразків, які містили фаги, здійснювали у 0,9% стерильному
розчині хлориду натрію (фізрозчині). Титр фагів визначали методом подвійного
агару [1]. Для нижнього шару використали агаризоване середовище (1,5%) на
основі гідролізованого молока. До верхнього шару входило 2 мл „м”якого” – 0,7%
агару, 1 мл розведеної у фізіологічному розчині фагової суспензії та 0,2 мл
бактеріальної культури в логарифмічній фазі росту. Чашки інкубували протягом
18–24 годин за умов оптимальної для росту штаму температури, після чого
підраховували число негативних колоній. Титр фагів виражали у „бляшкоутворюючих
одиницях” в перерахунку на 1 мл фагової суспензії (БУО/мл).
Загальну чисельність заквашувальної та сторонньої мікрофлори визначали:
кількість МКБ згідно з ГОСТ 10444.12, бактерій групи кишкових паличок (БГКП) –
ГОСТ 9225-84, дріжджів та пліснявин – ГОСТ 10444.11, кількість спороутворюючих
бактерій за Банниковою [3].
2.2. Дослідження бактерій на лізогенність
З метою визначення лізогенності штаму гідролізоване молоко інокулювали
(кількістю 1% від об’єму) досліджуваною нічною культурою, яку потім вирощували
за сприятливої температури впродовж 4 год. Пробу клітинної суспензії переносили
у чашку Петрі і, знявши кришку, опромінювали (лампа БУВ-15, відстань до об’єкта
35 см) протягом 10–40 с. Після опромінення суспензію клітин розбавляли 1:1 ГМ
та інкубували 4 год за умов оптимальної для росту штаму температури, періодично
(кожні 15 хвилин) визначаючи оптичну густину культури при довжині хвилі 600 нм.
Про лізогенність культури робили висновок, беручи до уваги характер її росту
після УФ-опромінення: зменшення оптичної густини бактеріальної популяції після
1,5–2,5 год „нормального” росту свідчить про лізис клітин, спричинений
індукованими профагами [49].
2.3. Препаративне отримання бактеріофагів
У роботі використовували концентровані та очищені вірусні суспензії, отримані з
фаголізатів. Для отримання фаголізатів скористалися наступними методами:
суцільного лізису чутливої культури на агаризованому середовищі [18];
фаголізису в рідкому поживному середовищі (ГБ).
Перший метод використовували на початку роботи, зокрема для проведення
електронномікроскопічних досліджень.
Для отримання суцільного лізису заздалегідь підбирали таке розведення фага, за
якого формувалося максимальне число негативних колоній, що не перекривалися. В
чашку Петрі з 25 мл 1,5% агаризованого гідролізату молока заливали верхній шар,
який містив 2 мл 0,6% агару, 1мл бактеріальної культури у log-фазі та 1 мл
фагової суспензії потрібного розведення (приблизно 104 БУО/мл). Чашки
інкубували за умов сприятливої для росту культури температури впродовж 15–17
годин, після чого на поверхню агару доливали 5 мл стерильного фізрозчину і
витримували при 4єС протягом 6–8 годин. Впродовж цього часу фагові частки із
товщі агару дифундували у фізрозчин. Даний метод дозволяє отримати з однієї
чашки майже 4 мл фаголізату титру 1010 БУО/мл.
Для проведення решти досліджень фаголізати отримували у рідкому поживному
середовищі. Експериментальним шляхом було встановлено, що фаголізати високого
титру можна отримати за умов інокуляції гідролізованого молока 4%
свіжоотриманою нічною бактеріальною культурою з одночасним додаванням
гомологічного фага титру 102–103 БУО/мл. Через 4,5–5 годин інкубування за
температури сприятливої для росту культури, спостерігали просвітління бульйону,
що свідчило про лізис бактеріальних клітин.
- Киев+380960830922