РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкти та матеріали досліджень
Тварини. У роботі використовували безпородних білих мишей вагою 18-20 грамів,
самців мишей лінії СВА вагою 16-18 грамів та кролів вагою 2000 – 2500 грамів.
Клiтини. Використовували культуру лейкоцитів нормальної донорської крові,
культуру клiтин мишей лiнiї L929, перевивну диплоїдну культуру фібробластних
клітин L-41, культуру лімфобластоїдних клітин людини МТ-4.
Вiруси та бактерії. У дослiдi по вивченню iнтерфероногенної активностi
препарату використовували вiрус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Iндiана,
люб'язно наданий вiддiлом по виробництву iнтерферону заводу по виробництву
бактерiйних препаратів “Біофарма”.
Для вивчення неспецифічної противірусної дії АЦС використовували вірус герпесу
ІІ типу, який отримували із везикулярної рідини, взятої від хворого (Інститут
урології та нефрології АМН України, м.Київ).
Дослідження анти-ВІЛ-активності АЦС вивчали на моделі зараження клітин МТ-4
вірусом імунодефіциту людини першого типу, штам BRU (одержаний від проф. K.J.
Krohn (Університет м. Тампере, Фінляндія).
Для вивчення продукції фактору некрозу пухлин використовували Staphylococcus
aureus, штам 209 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).
Препарати. В роботі використовували готовий комерційний препарат АЦС людини з
титром не нижче 1:160, виготовлений заводом по виробництву бактерійних
препаратів “Біофарма” та готовий медичний препарат преднізолону.
Реактиви та інші матеріали. Середовища для культивування клітин: середовище 199
(Інститут вірусних енцефалітів, Москва), середовище Хенкса (Інститут вірусних
енцефалітів, Москва), мінімальне середовище Ігла, RPMI-1640 (Sigma”). Барвники:
еозинат натрію, трипановий синій. Сироватка крові плодів корови (“Flow”),
сироватка крові великої рогатої худоби, трипсин (“Біофарма”), версен, набір
мітогенів: конканавалін А, фітогемаглютинін (“Difco”), ліпополисахарид
(“Sigma”); 3Н-тимідин, сцинтиляційна рідина ЖС-7, 7а, 107, 103. Мембранні
фільтри (“Синпор”). Мікропланшети (“Flow”) та культуральні планшети (“Nunc”),
(“Costar”), планшети для імунологічних досліджень. У роботі також
використовували солі, луги та кислоти (“Макрохім”) кваліфікації хч та чда,
антибіотики, гепарин, медичний етиловий спирт, HEPES (4-2-гідроксиетил –
1-пиперазинетан сульфокислоти) (“Sigma”), фізіологічний розчин хлориду натрію
(“Біофарма”) та інші реактиви.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Методика отримання антиретикулярної цитотоксичної сироватки
2.2.1.1 Приготування антигену. Кролячу антиретикулярну цитотоксичну сироватку
до тканин мишей отримували шляхом імунізації кролів антигеном, виготовленим із
селезінки та грудини (кісткового мозку) мишей.
Для отримання антигену мишей забивали знекровлюванням, селезінку та грудину
відбирали у стерильний посуд. Із селезінки знімали капсулу та багаторазово
відмивали фізіологічним розчином від еритроцитів, тканину селезінки розрізали
на маленькі шматочки, ще раз промивали і розтирали у фарфоровій ступці з
піском.
Кістковий мозок витискували безпосередньо у розтерту селезінку [31] і після
ретельного розтирання приливали фізіологічний розчин у п’ятикратному об’ємі від
ваги тканини та центрифугували 1 хв. при швидкості 1000 обертів. Надосадову
рідину пропускали через 4 шари марлі, осад викидали.
2.2.1.2. Імунізація тварин. Отриманий таким чином антиген вводили кроликам
породи Шиншила вагою 2,0-2,5 кг триразово у вушну вену: перший раз – 1,0 мл,
другий –1,5 мл, третій – 2,0 мл [6]. Інтервал між імунізаціями складав 7 днів.
Через тиждень після останнього введення антигену з вушної вени кролика брали
кров для перевірки титру цитотоксинів. Сироватку відділяли методом ретракції
згустку та дефібринували на шютель-апараті 30-45 хвилин. Дефібриновану плазму
відстоювали 48 годин при температурі +40С.
2.2.1.3. Визначення титру цитотоксичної сироватки. Титр сироватки визначали за
допомогою реакції зв’язування комплементу за наявністю гемолізу у системі. Для
титрування використовувалась гемолітична сироватка (гемолізин), отримана шляхом
імунізації кроликів еритроцитами барана (люб’язно наданих заводом по
виробництву бактерійних препаратів “Біофарма”). Для постановки реакції
зв’язування компліменту брали потрійний титр гемолізину. За титр гемолітичної
сироватки приймали останнє розведення, здатне у об’ємі 0,5 мл розчиняти 0,5 мл
3% завису еритроцитів при наявності 0,5 мл комплементу протягом 1 години при 37
0С.
Еритроцити барана отримували із стерильно відібраної дефібринованої крові,
еритроцити відмивали триразовим центрифугуванням у різних порціях
фізіологічного розчину. Відмивання завершували, якщо остання порція промивної
рідини була безбарвною.
Для постановки реакції використовували 3% завис еритроцитів (1 мл осаду
відмитих еритроцитів розчиняли у 33 мл фізіологічного розчину). Комплементом
слугувала сироватка крові морської свинки, отримана перед постановкою реакції.
Перед дослідом комплемент титрували для визначення його робочої дози.
Для цього брали комплемент у розведенні 1:10 та розливали його по пробірках у
об’ємі від 0,5 до 0,03 мл, після чого об’єм у кожній пробірці доводили до 1,5
мл фізіологічним розчином. Одночасно виготовляли гемолітичну систему –
розведену у потрійному титрі гемолітичну сироватку + 3% завису еритроцитів
барана, обидва інгредієнти змішували у рівних об’ємах та витримували у
термостаті 30 хвилин (сенсибілізація суміші), після чого її додавали по 1 мл у
пробірки з комплементом і пробірки ставили у термостат на 30 хв. За контроль
вважали зразки із 0,5 мл гемолітичної системи, 1,5 мл фізіологічного розчину та
0,5 мл завису ертироцитів+ 1,5 мл фізіологічного розчину.
Титром компл
- Київ+380960830922