РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Стан кровоносних судин та паренхіми надниркових залоз у нормі та у різні
терміни після дії загальної глибокої гіпотермії досліджувався у 140 білих
безпородних статевозрілих щурів-самців віком 3-4 місяці з масою тіла 160-200 г.
Вибір білих щурів в ролі експериментальних тварин зумовлювався даними
літератури про подібність структурної організації їх наднирників до таких
органів у людини [79] та відомостями про можливість відновлення життєдіяльності
цих тварин навіть після зниження температури їх тіла до 0єС [121]. Крім того,
ці тварини є найбільш вигідним об’єктом для групового експерименту.
Тварини розподілялися на дві групи: 20 тварин першої групи служили контролем,
120 тварин другої експериментальної групи піддавалися впливу холодового фактора
за прийнятою на кафедрі анатомії методикою до зниження їх ректальної
температури до +12-+13єС [149]. У відповідності до термінів дослідження у
постгіпотермічному періоді (на висоті гіпотермії, 1-шу, 3-тю, 7-му, 14-ту та
30-ту доби) білі щурі другої групи розподіляли на 6 підгруп - по 20 тварин у
кожній (табл. 2.1).
Тварини контрольної і дослідних груп до і після експерименту утримувалися в
нормальних умовах кафедрального віварію з дотриманням вимог “Правил проведення
робіт з використанням експериментальних тварин”, затверджених наказом МОЗ
України №755 від 12 серпня 1997 р., “Про заходи щодо подальшого вдосконалення
організації форм роботи з використанням експериментальних тварин”, “Загальних
етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених Першим Національним
конгресом з біоетики” (Київ, 2001р.) та Закону України №3447-IV “Про захист
тварин від жорстокого поводження” від 21.02.06 р. Вони перебували на
повноцінному харчуванні, без обмежень у питній воді, рухах, із збереженням
добових коливань у освітленні приміщення. З метою виключення впливу добового і
сезонного ритмів біологічної активності, експеримент проводився у
весняно-літній період, у ранковий час, перед годуванням.
Таблиця 2.1
Загальний розподіл тварин по групах, термінах і основних методах дослідження
Групи
тварин
Умови
експерименту
К-ть
тва-рин
Методи дослідження
ін’єкційний
метод виявлення судин та
метод В.В.Купрія-нова
гістоло-
гічні
електрон-номікрос-копічний
визначення вмісту кортизолу і адреналіну в плазмі крові
Контроль
20
ІІ
Вплив загальної глибокої гіпотермії
120
36
24
30
30
на висоті дії загальної глибокої гіпотермії
20
5
на 1-шу добу постгіпотермічного періоду
20
5
на 3-тю добу постгіпотермічного періоду
20
5
на 7-му добу постгіпотермічного періоду
20
5
на 14-ту добу постгіпотермічного періоду
20
5
на 30-ту добу постгіпотермічного періоду
20
5
Всього
140
42
28
35
35
Евтаназія щурів здійснювалася методом передозування ефіру, який використовували
для наркозу.
Для вивчення стану кровоносних судин, в тому числі різних ланок ГМЦР, та
паренхіми наднирників використовувався цілий ряд методів дослідження, основні
із яких представлені у таблиці 2.1. Серед цих методів наступні:
1) метод моделювання загальної глибокої гіпотермії;
2) ін’єкційний метод виявлення кровоносних судин;
3) метод виявлення кровоносних судин капсули наднирників за В.В.Купріяновим;
4) гістологічні методи дослідження стінки кровоносних судин та паренхіми
наднирникових залоз;
5) електронномікроскопічний метод дослідження кровоносних судин та паренхіми
наднирників;
6) імуноферментний та флюорометричний методи визначення в плазмі крові гормонів
пучкової зони кори та мозкової речовини наднирників – кортизолу і адреналіну;
7) морфометричний метод;
8) статистична обробка цифрових даних.
2.1. Метод моделювання загальної глибокої гіпотермії
Для експерименту тварин поміщали у невеликі клітки (одна клітка для однієї
тварини), які не обмежували їх рухів і дихання. Клітки знаходились у холодовій
камері, де підтримувалась постійна температура -32єС. Охолодження тривало 3-4
год. При цьому ректальна температура знижувалась з +38-+40єС до +12-+13 єС, що
відповідає температурним межам загальної глибокої гіпотермії (+10-+20 єС)
[121]. Вищезазначені режими охолодження і температурні межі відображені у
патенті на винахід [149].
2.2. Ін’єкційний метод виявлення кровоносних судин
З цією метою використовувалась суспензія паризької синьої у
ефірно-хлороформному розчиннику (10 г фарби на 100 мл розчинника, який
складався з ефіру і хлороформу у співвідношенні 3:1). Цю суспензію ін’єктували
в грудну частину аорти. Через 3-4 год після закінчення заповнення кровоносних
судин вищеназваною сумішшю, проводили забір надниркових залоз і фіксували їх в
10 % розчині нейтрального формаліну впродовж 14-ти діб.
На заморожуючому мікротомі виготовляли зрізи, товщиною 30-50 мкм, які
зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, просвітлювали в метиленовому
ефірі саліцилової кислоти і заключали в полістирол. В подальшому вивчали під
тринокулярним мікроскопом МС 300 (ТХР) при різних збільшеннях.
Для оцінки взаємної топографії кровоносних судин і паренхіми частину
ін’єкованого матеріалу, після його фіксації в 10% розчині нейтрального
формаліну, ми використали для приготування гістологічних зрізів з наступним
фарбуванням їх гематоксиліном і еозином. Нами подано заявку на винахід “Спосіб
поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхіми тканин шляхом
ін’єкції судин та фарбування гематоксиліном і еозином” (пріоритет від
31.03.2008р. за № 2008 04032).
2.3. Метод виявл