Ви є тут

Разработка тест-систем и технических средств ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля

Автор: 
Светличкин Вячеслав Владимирович
Тип работы: 
Докторская
Год: 
2002
Артикул:
271671
129 грн
(417 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ................................................... 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТ УРЫ......................................... 16
ГЛАВА 1. Современное состояние оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля
16
Критерии и методы оценки безопасности и качества
животноводческих производств и продукции................... 16
Микробные контаминации и их оценка......................... 20
Идентификация продукции и определение
фальсифицирующих примесей.................................. 53
Методы генной диагностики и их роль в оценке безопасности
и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля 65
Автоматизированные системы и приборы контроля качества и
безопасности............................................... 92
ДНК-микрочиповая технология................................ 98
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................... 105
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.................. 105
Микробиологические методы исследований.................... 105
Методы бактериологического анализа эшерихий, сальмонелл,
стафилококков............................................. 106
Определение чувствительности бактерий к действию
антибиотиков.............................................. 109
Метод выращивания бактерий в полужидком агаре на
мембранных фильтрах....................................... 109
Получение и определение Ь-форм бактерий................... 110
Электронномикросколические исследования................... 110
Методы ДНК-диагностики.................................... III
3
2.3.1. Выделение и очистка ДНК бактерий........................... 111
2.3.2. Выделение и очистка ДНК из тканей животных................. 113
2.3.3. Включение тритиевой метки в ДНК методом ник-трансляции .. 114
2.3.4. • Включение биотиновой метки в ДНК методом ник-трансляции 115
2.3.5. Включение метки в ДНК методов «рассеяной» затравки 116
2.3.6. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции..................................................... 117
2.3.7. Точечная ДНК-гибридизация с биотиновой меткой............ 118
2.3.8. Гибридизация ДНК с тритиевой меткой...................... 119
2.3.9. ДНК-гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-
зондами меченными биотином................................. 120
2.3.10. Методика гибридизации колоний............................ 125
2.3.11. Методика полимеразной цепной реакции..................... 126
2.4. Методика иммудиффузии в геле............................. 127
2.5. Статистическая обработка результатов....................... 128
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................. 129
ГЛАВА 3. Разработка методов и тест-систем индикации и идентификации микроорганизмов в объектах ветеринарно-санитарного контроля на основе ДНК-диагностики............. 129
3.1. Идентификация бактерий в объектах ветеринарносанитарного и экологического контроля на основе гомологии нуклеиновых кислот методом гибридизации колоний.................... 129
.2. Разработка модификации метода ускоренной идентификации
бактерий на основе гомологии ДНК меченной биотином 136
3.3. Разработка тест-систем индикации бактерий с
использованием генных зондов............................... 145
3.4. Разработка метода дифференциального определения
вегетативных и Ь-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации
на мембранных фильтрах..................................... 161
34
гигантские, иногда теряющие подвижность, способность к образованию фимбрий и т.д. Б-Я-изменчивость ассоциируется с частичной или полной потерей вирулентности. У пневмококков изменчивость колонии от Б к Я-форме ассоциируется с потерей капсульного полисахарида, а соответственно - типосиецифического антигена и вирулентности.
При выращивании бактерий на искусственных питательных средах Я-варианты обычно получают селективное преимущество и имеют тенденцию накапливаться в популяции. Обратный процесс - накопление Б-вариантов, можно наблюдать при пассировании бактерий через организм животного.
Большинство бактерий в Б или М- форме являются вирулентными или, у сапрофитов, более приспособленными к естественным условиям обитания.
Очевидно, что диссоциация бактерий, постоянно идущая в природных популяциях бактерий, создает фенотипическое разнообразие форм на единой генетической основе, что имеет большое приспособительное значение. Выживают и накапливаются варианты, наиболее приспособленные к конкретным условиям окружающей среды (Громов Б.В., Павленко Г.В.,1989, Калина В.П.,1988, Паников Н.С.,1991, Беагс! Г, 1987, Ри1со Р Я.,1991).
Данная закономерность развития популяции бактерий нуждается в детальном изучении для прогнозирования инфицирования объектов ветеринарно-санитарного контроля, а также создания надежных методов индикации и идентификации различных форм микроорганизмов.
Воздействие неблагоприятных факторов на популяцию бактериальных клеток вызывает изменение морфобиологических свойств микроорганизмов.
Морфологические изменение бактериальных клеток наблюдается как при искусственном воздействии биотических и абиотических факторов, так и при естественном старении клеточной популяции.
Воздействия на клетки можно разделить на физические, химические и биологические. К физическим факторам относят: изменение показателей
35
влажности, температуры, давления и тд.; к биологическим природный или моделированный антагонизм, а также действие природных или синтетических антибиотиков (Егоров Н.С.,1994, Шлегель Г., 1987).
Основная часть условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, включая S. aureus, относится к группе мезофилов, которые развиваются при оптимальной температуре от 25 до 381}С. При нарушении температурного режима часть популяции гибнет, а часть бактериальных клеток изменяет морфологию, в результате чего переходит в стадию гетероморфизма с последующей L-трансформацией. Повышение температурного порога приводит к большей гибели микроорганизмов, чем понижение, за счет коагуляции внутриклеточных белков.
Антибиотики разделяются по механизму их действия на бактериальные клетки. При этом группы антибиотиков способны влиять на образование L-форм с различной степенью интенсивности (Николаев Ю.А., Воронина
Н.А.,1999).
Антибиотики, специфически воздействуя на клеточную стенку, инициируют образование L-форм, которые приобретают устойчивость к действию этих агентов. К таким препаратам относятся антибиотики пенициллинового и цефалоспоринового ряда.
Образование стабильных L-форм вызывают такие антибиотики, как хлорамфеникол, новобиоцин, стрептомицин, эритромицин, гентамицин и др., т.е. препараты, не нарушающие синтез клеточной стенки.
Возможность образования L-форм под действием антибиотиков, не влияющих непосредственно на синтез пептидогликана, может объясняться тем, что при сравнительном изучении антибиотиков с различным механизмом действия не наблюдается избирательного повреждения определенных процессов обмена и соответственно тех органоидов клетки, с которым эти процессы преимущественно связаны. Эти препараты
нарушают обмен веществ в клетке, и тем самым переводят микроорганизмы в фазу гетероморфизма и L-трансформацию (Абаджиева А.Н.,1987, Иванов