Оглавление
Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................... 5
1. ВВЕДЕНИЕ........................................................... 7
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................12
2.1. Классификация и структура вируса бешенства........................12
2.2. Антигенные свойства вируса бешенства..............................14
2.3. Характеристика фиксированных штаммов вируса бешенства.............16
2.4. Культивирование фиксированных штаммов вируса бешенства............22
2.5. Антирабические вакцины для иммунизации животных и общие
требования, предъявляемые к ним..................................31
2.6. Заключение но обзору литературы...................................41
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................43
3.1. Материалы и методы................................................43
3.1.1. Материалы.......................................................43
3.1.1.1. Вирусы........................................................43
3.1.1.2. Животные......................................................43
3.1.1.3. Культуры клеток...............................................44
3.1.1.4. Среды и растворы..............................................44
3.1.1.5. Реактивы......................................................44
3.1.1.6. Оборудование..................................................45
3.1.2. Методы..........................................................46
3.1.2.1. Культивирование вируса in vitro...............................46
3.1.2.2. Определение инфекционной активности вируса....................47
3.1.2.3. Определение стерильности......................................48
3.1.2.4. Определение уровня протективного вирусспецифического антигена в вируссодержащем материале............................48
3.1.2.5. Определение локализации вирусспецифических антигенов в инфицированных клетках ПС.......................................48
3.1.2.6. Определение патогенности вакцинных штаммов для животных 49
3.1.2.6.1. Определение инвазивности....................................49
2
Оглавление
3.1.2.6.2. Определение ириживляемости...................................50
3.1.2.6.3. Определение реверсибельности.................................50
3.1.2.7. Определение эффективности инактивации вируса теотропином и сульфатом меди....................................................51
3.1.2.8. Приготовление стабилизирующего раствора........................51
3.1.2.9. Лиофилизация вируссодержащего материала........................52
3.1.2.10. Приготовление лабораторных образцов инактивированной вакцины...........................................................52
3.1.2.11. Определение иммуногенности....................................52
3.1.2.12. Очистка вируса, выделение РНК, синтез кДНК....................53
3.1.2.13. Постановка ОТ-П1ДР и анализ продуктов ПЦР.....................54
3.1.2.14. Статистическая обработка результатов исследований.............54
3. 2. Результаты собственных исследований...............................55
3.2.1. Изучение культуральных свойств вакцинных штаммов РБ-71 и ТС-
80 вируса бешенства...............................................55
3.2.1.1. Чувствительность перевиваемых культур клеток к вирусу бешенства.........................................................55
3.2.1.2. Изучение параметров культивирования штаммов РБ-71 и ТС-80 вируса бешенства в культуре клеток ГТС............................58
3.2.1.2.1. Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вируса...................................58
3.2.1.2.2. Изучение динамики накопления вируса в культуре клеток........59
3.2.1.2.2.1. Изучение локализации и накопления вирусспецифических
антигенов в клетках ПС............................................61
3.2.1.3. Изучение цитопатогенного действия вируса бешенства.............64
3.2.2. Изучение генетической стабильности штаммов РБ-71 и ТС-80 при пассировании в чувствительных клеточных системах..................73
3.2.3. Изучение патогенности штаммов РБ-71 и ТС-80 вируса бешенства для животных......................................................75
3.2.3Л. Вирулентные свойства............................................75
_______________________________________________________________________ 3
Обзор литературы
Первые три протеина являются связанными с РНК и образуют рибонуклеопротеин. Данный РНК-комплекс контролирует транскрипцию и репликацию вируса.
Из трех белков, образующих вместе с РНК спиралевидный нуклеокапсид, Ы-белок является основным внутренним белком вируса. При анапизе первичной нуклеотидной последовательности гена Ы-белка нескольких штаммов вируса бешенства был продемонстрирован исключительно высокий уровень консервативности генома, отражением которого явилась высокая степень гомологии антигенов между различными штаммами вируса бешенства и родственных ему вирусов в структуре рибонуклеопротеина [92,121,132].
Фосфопротеин является белком нуклеокапсида и участвует в инициации процесса транскрипции и репликации РНК [44,142].
К нуклеокапсиду прилегает матричный белок М. Предположительно, его функцией является стягивание звеньев рибонуклеопротеида в цилиндр со спиральной симметрией.
В состав наружного слоя оболочки вируса бешенства входит гликопротеин в. Гликопротеин составляет 44-47 % от общего количества белка и образует структурную основу для поверхностных отростков (пепломеров), выступающих из мембранных белков.
Гликопротеин содержит три домена: эктодомен, трансмембранный домен и эндодомен [96,98].
Экто - и эндодомен являются растворимыми фракциями гликопротеина. Основные функциональные регионы, включая нейтрализуемые эпитоны, локализованы на эктодомене. Трансмембранный домен, кроме выполнения функций мембранного заякоривания и внутриклеточного транспорта гликопротеина, необходим для формирования функциональной целостности белка, так как растворимые домены гликопротеина не способны индуцировать протективный иммунитет [97]. Эндодомен выполняет функции взаимодействия с М белком и внутриклеточного транспорта гликопротеина.
13
Обзор литературы
Эктодомсн гликопротеина играет ведущую роль в патогенезе бешенства: в прикреплении вирионов к мембране клетки, как инициирующий шаг вирусной инфекции, и связывание с вируснейтрализующими антителами [123].
Сравнительно недавно среди структурных белков вируса бешенства обнаружен Ь-белок, который представляет собой агрегат предшественников других вирусных белков, высокоспецифичных и ответственных за транскриптазную активность вириона [142,153]. На данный момент этот протеин является наименее изученным белком вируса бешенства. Одной из основных его характеристик является гомология с другими белками вирусов порядка Мопог^оуйа1ез [84,153].
Таким образом, в настоящее время исследователи имеют четкое представление о молекулярной структуре вируса бешенства и участии его структурных компонентов в процессе репродукции возбудителя.
2.2. Антигенные свойства вируса бешенства
Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА. ПА, анти-ГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) антитела [9,50]. Все вирусные белки обладают аитигенностыо, но не все обеспечивают формирование протективного ответа
[95.103].
Вирион содержит два основных антигена, участвующих в иммунном ответе. Один из них представляет собой гликопротеин О вирусной оболочки, второй - внутренний нуклеопротеин N вириона [96,109,120,131,133]. Гликопротеин является антигеном, который ответственен за индукцию вирус нейтрализующих антител и формирование иммунитета у животных
[79.103]. Индуцирование нейтрализующих антител гликоиротеином зависит в основном от сохранения им трехмерной структуры, несмотря на то, что в настоящее время идентифицированы линейные детерминанты данного полипептида [93,153]. Гликоиротеин также является мишенью для Т-
14
- Київ+380960830922