СОДЕРЖАНИЕ
Введение ............................................................. -.. 6
Глава I. Обзор литературы.......................................................................................................10
1.1. Фотофизические и фотохимические процессы в молекулах индола, триптофана и их производных ................................................................................................................10
1.1.1. Спектроскопия основного состояния.............................................................................. 10
,1.1.2. Первичные фотопроцессы в молекуле триптофана.....................................................................11
1.1.3. Фотоионизация индола и триптофана.......................................................................... -...13
1.2. Термические и фотохимические реакции кинуренина и его производных..„17
1.2.1. УФ фильтры хрусталика глаза.......... ~.........................................................................17
1.2.2. Термические реакции.......................................................................................... 18
1.2.3. Кинуренин и его производные в процессах старения хрусталика глаза и катарактогенезе...........-.............................................. ...-.........................................21
1.2.4. Фотохимические реакции...........................................................................................23
1.2.5. Механизмы ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний в органических молекулах............................................................................................................ ......26
1.3. Постановка задачи. ......-....................................................................... -.....................................................................27
Глава II. Экспериментальная часть..................... И1ни»м»|м>нм1мм»т1>мчжиннн 30
2.1. Материалы и реактивы -........................................................................ -.30
2.2. Стационарные методы исследования..................................................................................... 31
2.2.1. Оптическая спектроскопия....................................................................................... 31
2.2.2. Фотолиз...........................-..............................................................................31
2.2.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)................................................................32
2.3. Времяразрсшенные методы исследования...................................................................................32
2.3.1. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз........................................................................32
2.3.2. Фемтосекундный лазерный импульсный фотолиз.......................................................................34
2.3.3. Время-коррелированный счет фотонов (ВКСФ)................................................................................................................................................35
2.3.4. Флуоресценция с фемтосекундным временным разрешением (ир-сопуегаоп)..........................-......................-............................................................35
2.4. Программное обеспечение.................................................................................................:...............................................................................................36
2.5. Анализ данных флуоресценции............................. .............................................................36
Глава III. Фотоионизация водных растворов индола, триптофана и их производных.......................................................„.........„.......38
3.1. Введение..........................................................38
3.2. Однофотонная ионизация триптофана и его производных...............38
3.2.1. Зависимость выхода ионизации от энергии лазерного излучения 38
3.2.2. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для М-ацетилтриптофана (Л/АТгрН) и /.-триптофана (/,-ТгрН)..............42
3.2.3. Зависимость квантового выхода внутримолекулярного переноса протона (ВПП) от температуры для /,-ТгрН..................... „..44
3.2.4. Реакции синглетного возбужденного состояния триптофана „.....46
3.2.5. Численное моделирование полученных результатов...............48
3.3. Конкуренция между фотоионизацией из состояния *Б и релаксацией ‘Б—>Бі в молекулах индола и триптофана ....................„.................49
3.3.1. Зависимость квантового выхода радикалов индола и /.-триптофана от температуры в различных растворителях............................„..50
3.3.2. Механизм колебательной релаксации *5-»5і.....................52
3.4. Заключение ......................................................53
Глава IV. Фотофизические и фотохимические процессы в молекуле кинуренина
-.......................................-............................~....55
4.1. Введение..........................................................55
4.2. Спектроскопия основного состояния............................... 55
4.3. Ультрабыстрая динамика гибели синглетных возбужденных состояний КМ и ЗОНКИ............................................................. 60
4.3.1. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения КМ..................................................... 56
4.3.2. Квантовый выход флуоресценции КМ и его зависимость от температуры.........................................................68
4.3.3. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения ЗОНКМ................................................ 71
4.3.4. Релаксационная динамика состояния 5ь„........................72
4.3.5. Механизм ультрабыстрого безизлучательного перехода —>5о......72
4.4. Фотохимические свойства триплетного состояния КМ..................75
4.4.1. Фотолиз КЫ, сенсибилизированный ацетоном.....................75
3
4.4.2. Прямой фотолиз КЫ в водных растворах...........................81
4.4.3. Зависимость квантового выхода триплетного состояния КМ от растворителя........................................................ 82
4.5. /Двухфотонная ионизация КЫ и ЗОНКЫ..................................86
4.5.1. Спектры промежуточного поглощения интермедиатов КЫ и ЗОНК1М....86
4.5.2. Механизм фотоионизации КИ и ЗОНКХ........................ „...92
4.6. Заключение 94
Глава V. Реакции тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза................................96
5.1. Введение.......................................................... 96
5.2. Методика экспериментов .......................................... 96
5.3. Реакции тушения триплетного состояния КЫ............................97
5.3.1. Аскорбат.......................................................97
5.3.2. Глутагион восстановленный.................................... 99
5.3.3. Триптофан................................................ 101
5.3.4. /У-ацетил-/,-тирозин .........................................102
5.3.5. /У-ацетил-/.-гистидин, М-ацетил-/,-метионин, /.-цистеин.......103
5.3.6. Кислород......................................................103
5.4. Заключение....................................................... 104
Глава VI. Фотохимическая активность аддуктов кинуренина с аминокислотами гистидином, лизином, цистеином и антиоксидантом глутатионом.................106
6.1. Введение....................................................... 106
6.2. Спектроскопия основного состояния..................................107
6.3. Ультрабыстрая динамика гибели состояния ......................... 109
6.4. Триилетные состояния и радикалы....................................112
6.5. Фоторазложение водных растворов аддуктов......................... 114
6.6. Заключение................................................... 118
Выводы............................................................ 119
Список литературы...........................................................120
4
Список используемых сокращений
фл флуоресценция
ион ионизация
ИКК интеркомбинационная конверсия
ВК внузренняя конверсия
ВПП внутримолекулярный перенос протона
БГ безизлучательная гибель
L-ТфН L-триптофан
ЛгАТфН М-ацстил-Ь-триптофан
IH индол
KN кинурснин
30HKN З-гидроксикинуренин
СКА карбоксикетоалкен
Ас ацетон
AsH2 аскорбат
GSH глутатион
НАДН никотинамидадениндинукпеотид
Cys цистеин
Lys лизин
His гистидин
Введение
Ультрафиолетовое излучение Солнца, достигающее поверхности нашей планеты, в небольших дозах оказывает- благотворное воздействие на здоровье человека - повышает активность иммунной системы, стимулирует выработку витамина Д, а также ряда гормонов, таких как мелатонин и серотонин («гормон бодрости»). Длительная недостаточность ультрафиолетового излучения может приводить к так называемому «световому голоданию» или «зимней депрессии» - заболеванию, сопровождающемуся нарушением обмена веществ, снижению иммунитета, быстрой утомляемости и т.д. Избыточные дозы облучения могут также оказывать негативное воздействие на человеческий организм - фотоповреждения белковых молекул могут приводить к изменению активности или гибели клеток, что в результате может приводить к развитию таких заболеваний как рак кожи, злокачественная меланома, катаракта и другие. В настоящее время механизмы возникновения и развития этих заболеваний остаются, во многом, неизвестными.
По степени воздействия на ткани живых организмов, ультрафиолетовое излучение делится на три диапазона - ближний, УФ-А (315-400 нм), средний УФ-Б (280-315 им) и дальний ультрафиолет УФ-С (280-100 нм). Коротковолновое УФ-С излучение потенциально является наиболее опасным для белковых молекул, т.к. оно может приводить к прямому фотораспаду молекулы белка и/или прямой фотоионизации большинства аминокислот, являющихся структурными единицами этих макромолекул. К счастью, УФ-С излучение практически полностью поглощается озоновым слоем и верхними слоями атмосферы. Излучение УФ-Б диапазона, на 90% поглощаемое земной атмосферой, является более мягким, однако оно также способно инициировать необратимые изменения в функционировании белков посредством фотоионизации таких ароматических аминокислот, как триптофан и тирозин. И, наконец, длинноволновое УФ-Л излучение может приводить к фотоповреждениям клеточных структур посредством сснсибилизнроваиия реакционных форм кислорода, свободных радикалов и/или прямой реакции хромофоров с аминокислотными остатками белков. УФ-А излучение является наиболее опасным для живых существ, поскольку оно достигает поверхности Земли с м ин имал Ы! ым и потеря м и.
Кожа и органы зрения человека в наибольшей степени подвержены воздействию солнечного ультрафиолетового излучения. Наиболее злокачественные заболевания этих органов, такие как рак и катаракта, развиваются примерно у половины населения земного шара, перешагнувшего рубеж 65 лет [1,2]. Широкое распространение этих заболеваний
6
обуславливает их высокую социальную и экономическую значимость. Выявляемые клинически изменения соответствуют, как правило, необратимым стадиям заболевания, когда терапевтическое вмешательство малоэффективно. Хирургическое вмешательство является основным методом лечения этих заболеваний, т.к. лекарств, способных устранить злокачественную раковую опухоль или восстановить прозрачность хрусталика, в настоящее время не существует. Важно отметить, что большая часть ведущихся в мире исследований производится научными группами медицинской и биологической направленности. В результате их деятельности накоплен значительный материал об изменениях химического состава, морфологии и ряда других важнейших свойств кожи и органов зрения в процессах развития этих заболеваний. Тем не менее большая часть этих данных имеет качественный характер, не позволяющий создать адекватную модель химических процессов, протекающих в соответствующих тканях. Таким образом, исследование первичных фоторсакций, протекающих в тканях человеческого организма, является актуальной задачей для понимания механизмов развития различных заболеваний, индуцированных солнечным УФ излучением, а также разработки лекарственных препаратов, направленных на ингибирование нежелательных процессов.
Ткани кожи и органов зрения обладают различным белковым составом, однако большая часть белков содержит аминокислоту триптофан, который являегся основным хромофором белковых молекул в УФ-Б диапазоне. Фотоионизация триптофана может приводить к фотоинактивации ферментов и фотоиндуцированному повреждению белков, что, как уже было отмечено, может являться начальной стадией развития различных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования фотохимии триптофана на протяжении нескольких последних десятилетий, несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана, остаются открытыми. Прежде всего остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а .также природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции.
Зашита органов зрения от солнечного ультрафиолетового излучения осуществляется преимущественно группой низкомолекулярных соединений, содержащихся в хрусталике глаза. Эти соединения - кинуренин и его производные - являются природными метаболитами аминокислоты триптофан и обладают поглощением в УФ-А диапазоне. Фотохимические реакции этих соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения являются очень слабыми фотосенсибилизаторами; на этом основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами, предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было
7
показано, что фотовозбужденные состояния кинурснина могут окислять ряд биологически важных соединений, таких как цистеин и НАДИ, т.е. они способны наносить фотоновреждения органическим молекулам ближайшего кружения. Исследования термических реакций кинурснинов показали, что эти соединения являются нестабильными при физиологических условиях. Спонтанное дезаминирование приводит к образованию химически активных ненасыщенных соединений, которые MOiyr присоединяться к нуклеофильным аминокислотным остаткам белков - гистидину, лизину и цистеину. Белки, модифицированные молекулами УФ фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что, несмотря на эффективную защиту от УФ излучения, кинуренины могут участвовать в реакциях фотоновреждения белков хрусталика и развития катаракты. В настоящее время механизмы этих реакций остаются неизвестными.
Отмстим, что фотохимические реакции гомогенных растворов триптофана и кинурснина могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофан присутствует преимущественно в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (меж- и внутриклеточное пространство, плотная упаковка белков хрусталика) могут существенно отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и кинурснина и их реакций является необходимым для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живых организмах.
Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизичсских и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинурснина, изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и возможных реакций этих частиц с молекулами локального окружения. Исследования проводились с использованием методов времяразрешепной оптической спектроскопии (УФ и видимый диапазон длин волн) в широком временном диапазоне: от нескольких сотен фемтосекунд до нескольких десятков часов.
8
I
(
Целями данной работы являются:
(1) Исследование влияния параметров среды (температура, pH среды, растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.
(2) Исследование механизма ультрабыстрой дезактивации возбужденных состоянии кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, значение pH среды, температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.
(3) Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина, образующегося под действием УФ излучения, но отношению к ряду соединений, содержащихся в хрусталике глаза.
(4) Исследование фотохимической активности ковалентно-связанных аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике глаза.
Настоящая диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы.
В первой главе диссертации приведен обзор литературы по фотофизическим и фотохимическим процессам с участием триптофана, кинуренина и родственных им соединении. Также представлен обзор термических реакции кинуренина, которые имеют место в хрусталике глаза и приводят к существенным изменениям фотохимических свойств этой молекулы.
Вторая глава посвящена описанию используемого оборудования, программного обеспечения и методик проведения экспериментов.
В третьей главе представлено исследование влияния температуры и растворителя на механизм однофотонной ионизации триптофана и обсуждаются вклады различных возбужденных состояний в эту фотореакцию.
В четвертой главе приведено исследование первичных фотопроцессов, протекающих в молекуле кинуренина, и обсуждаются механизмы ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний и фотоионизации.
Пятая глава посвящена реакциям тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза.
В шестом главе диссертации приведены доказательства того, чю ковалентное присоединение кинуренина к аминокислотам и антиоксидантам приводит к увеличению фотохимической активности образующихся аддукгов.
9
Глава I. Обзор литературы
1.1. Фотофизические и фотохимические процессы в молекулах индола, триптофана и их производных
1.1.1. Спектроскопия основного состояния
Основными хромофорами белковых молекул являются ароматические аминокислоты фенилаланин, тирозин и триптофан, поглощающие УФ излучение в диапазоне 200-310 нм. Спектры поглощения основных состояний данных аминокислот, а также их химические структуры представлены на Рис. 1.1 [3]. Первая электронная полоса поглощения Бо-^! триптофана, его хромофора (индола) и их производных лежит в области 260-310 нм (й2зо ~ 6x103 М ’см'1 для индола). Данная полоса поглощения является следствием наложения двух электронных переходов, обозначаемых 1Ьа<-‘А и 'Ьь<—1 А. Вторая полоса поглощения 5о—»Бг триптофана расположена вблизи 220 нм и обозначается как 'В<—'а (£>20 ~ 30x10 М^см*1 для индола). Для фенилаланина и тирозина первая полоса поглощения совпадает с переходом ’В2и<—' А[е бензола. Выло показано, что уровни энергии нижних синглстных возбужденных состояний данных аминокислот являются
СООН
Триптофан
О
О
5
* Ю2
10
200 240 280 320
А, нм
Фенилаланин
Рис. 1.1. Химические структуры и спектры поглощения водных растворов (pH 6) [31 аминокислот триптофан, тирозин и фенилаланин.
близкорасположенными, и в белках возможен последовательный перенос энергии электронного возбуждения: фенилаланин -» тирозин —> триптофан [3]. По этой причине триптофан дает основной вклад во флуоресценцию белковых молекул.
С точки зрения фотохимии белковых молекул, триптофан представляет наибольший интерес по следующим причинам: (1) среди ароматических аминокислот триптофан, несомненно, обладает наибольшим коэффициентом экстинкции в УФ диапазоне 260-310 нм и (2) спектр поглощения триптофана частично перекрывается со спектром солнечного излучения, достигающего поверхности нашей планеты (А. > 280 нм). По этим причинам триптофан играет важную роль в фотодезактивации ферментов [4], а также в развитии заболеваний кожи и органов зрения [5].
1.1.2. Первичные фотопроцессы в молекуле триптофана
Молекула триптофана (ТгрН), поглотив квант света, возбуждается в колебательно возбужденное синглетное состояние *8 (в дальнейшем будет именоваться как предфлуоресцентное нерелаксироваиное состояние), основным каналом гибели которого является релаксация в нижнее синглетное возбужденное состояние Б|. Альтернативным каналом гибели состояния может быть фотоионизация с образованием катион-радикала ТгрН*+ и сольватированиого электрона е^,бв [б]. Каналами гибели состояния Бі являются
флуоресценция, интеркомбинационная конверсия (ИКК) в триплетиое состояние, ионизация с образованием радикала и сольватированиого электрона, а также протонирование индолыюго кольца в возбужденном состоянии через растворитель или внутримолекулярный перенос прогона (ВПП) с последующей быстрой конверсией в короткоживущее протонированное триплетиое состояние (г~30 не) [6-8]. Перечисленные процессы схематично представлены на Рис. 1.2. Аналогичная схема реакций, за исключением ВГ1ІІ, имеет место и для молекулы индола [6]. Ниже данные реакции рассмотрены более подробно.
Многочисленные исследования показали, что флуоресценция триптофана существенно зависит от свойств окружающей среды. При комнатной температуре в нейтральной среде квантовый выход флуоресценции триптофана составляет величину Ф,дт = 0.13-0.19 [7,9-12], которая уменьшается с увеличением температуры и уменьшением значения pH среды [6,7,9,10,13]. Время жизни флуоресценции триптофана составляет значение 9 не в щелочных растворах, 3 не в нейтральных растворах и 0.66 не при pH 1 [7]. В настоящее время высокая чувствительность флуоресценции триптофана к свойствам окружающей среды широко используется для изучения структуры белковых молекул [14].
- Київ+380960830922