Оглавление
Оглавление............
Введение.........................................................................6
Глава 1: Фотофизичсскис характеристики флуорофоров и влияние на них межмолекуляпного взаимодействия. Методы определения фотофизических параметров в системах-с локализованными донорно-акнепгорнымипапами..... 13
1.1 Фотофизические характеристики флуорофоров и влияние на них локальных факторов............................................................................................................:.13
1.1.1 Вероятность переходов в двухуровневой системе .........................13
1.1.2 Переходы между виброниыми уровнями. Фактор Франка-Кондона..............14
1.1.4 Фотофизические процессы в молекулах сложных органических соединений..... 17
1.1.4 Влияние межмолёкулярного взаимодействия на фотофизические параметры флуорофоров .'...............;..;.....*.................. :.......... 22
1.1.5 Перенос энергии в системах флуорофоров.................................24
1.2. Спектроскопические методы определения фотофизических параметров .........26
1.2.1 Классическая флуоримстрия....................................... 27
1.2.2 Нелинейная флуориметрия ..............................;...............30
1.2.3 Экспериментальная установка...................................’........:......36
1.2.3.1 Наносекундный лазерный флуориметр/флуорометр. .................. 36
1.3. Модели фотофизических процессов с учётом процессов в возбужденном ‘ состоянии:............... 1..........;......................................................................... 40
1.3.1. Модель фотофизических процессов с учетом фотоионизации................40
1.3.2 Определение фотофизических параметров триптофана методом нелинейной , флуориметрии............................................................. 43
1.4 Модели фотофизических процессов в системах с локализованными донорно-акцепторными парами..................................................... 47
1.4.1 Понятие Л ДАЛ.....’..........................................................................................................47
1.4.2 Модель коллективных состояний............;......................'......49
1.4.3 Определение скорости переноса энергии в флуоресцентном белке шІІТРІ 52
Глава 2: Исследование влияния взаимодействия с лнганламн-анионамн на . фотофизические параметры ураннла.................................................55
2.1 Фотофизические харак теристики уранила.....................................55
2.1.1 Спектральные характеристики и характерные скорости переходов между энергетическими уровнями в комплексах уранила................................55
2
г
2.1.2 Дезактивация возбужденного состояния комплексов уранила...................58
2.1.3 Влияние лигандов на фотофизические параметры уранила....................60
2.2 Комплексообразование. Флуоресцентный отклик смеси комплексов уранила........61
2.3 Исследование динамики релаксации возбужденных состояний комплексов уранила
................................................................................65
2.3.1 Исследование зависимости кинстик затухания флуоресценции комплексов уранила от внешних факторов................................................65
2.3.2 Определение индивидуальных времен жизни первого возбужденного состояния комплексов уранила.........................................................67
2.3.3 Исследование температурной зависимости затухания флуоресцентного отклика комплексов уранила.........................................................74
2.3.4 Исследование температурной зависимости скорости релаксации верхнего возбужденного состояния комплексов уранила.................................77
2.4 Нелинейная флуориметрия комплексов уранила. Решение обратной задачи.........78
2.4.1 Нелинейная флуориметрия комплексов уранила..............................78
2.4.4 Анализ влияния лигандов на фотофизические параметры комплексов уранила.83
2.5 Определение индивидуальных фотофизичсских параметров комплексов уранила в. смеси методом матричной флуориметрии............................................85
2.6 О возможности использования лазерной флуориметрии для исследования сорбции, уранила на поверхности кремниевых микрочастиц*..................................87
Глава 3. Исследование взаимодействия молекул гумннового вещества с пнпеном и механизмов взаимного влияния на фотофизические параметры........................92
3.1 Фотофизические характеристики системы иирен-ГВ..............................92
3.1.1 Сведения о структурных и фотофизичсских характеристиках пирена и ГВ.....92
3.2 Исследование фотофизичсских процессов в молекулах пирена и ГВ при возбуждении в УФ (266 им) методами нелинейной и кинетической флуориметрии.......97
3.2.1 Фотодеградация пирена под действием лазерных импульсов..................97
3.2.2 Определение фотофизических параметров пирена методами нелинейной и кинетической флуориметрии.................................................101
3.2.3 Определение фотофизических параметров ГВ методами нелинейной и кинетической флуориметрии.................................................103
3.3 Исследование процесса связывания пирена молекулами ГВ методами классической спектроскопии..................................................................104
3.4 Исследование гипотезы о наличии переноса энергии в системе пирен-ГВ........108
3.4.1 Гипотеза о переносе энергии в системе пирен-ГВ.........................108
3.4.2 Исследование переноса энергии в системе пирен-ГВ методом нелинейной флуориметрии..............................................................112
3
Выводы........................................................................114
Литература.....................................................................115
4
Принятые сокращения
FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer;
ВФ - волновая функция;
ТВ - гуминовыс вещества;
КР — комбинационное рассеяние;
ПА У - полиароматические углеводороды;
СОС - сложные органические соединения;
ФБ - флуоресцентный белок;
Н11Ф - нелинейная лазерная флуоримстрия;
TRLIF - time-resolved laser-induced fluorescence;
ДА пара - донорно-акцепторная пара;
ЛДАП - локализованная донорно-акцепторная пара;
ОМА - оптический многоканальный анализатор.
5
Введение
Влияние межмолекулярных взаимодействий на фотофизические параметры комплексов гуминовых веществ с пирсном и уран ила с лигандами-анионами в воде широко исследуется методами оптической спектроскопии [1, 2]. Актуальность подобных исследований обусловлена как существенной» фундаментальной составляющей, так и прикладной - возможностями использования их результатов в области мониторинга окружающей среды (использования гуминовых веществ в качестве флуоресцентных биоиндикаторов наличия экотоксикантов [3], детектирования в воде низких концентраций комплексов урана [4, 5]) и для оптимизации технологического процесса добычи урана методом подземного выщелачивания [6]. Исследование межмолекулярных взаимодействий тесно связано с задачей определения молекулярных фотофизических параметров как характеристик, отражающих изменения окружения флуорофоров и их структуры. Возможности флуоресцентного анализа значительно расширяются с применением' лазерных методов, которые в дополнение к традиционным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять молекулярные фотофизические параметры, флуорофоров (время жизни, сечение поглощения, скорость межмолекулярного переноса энергии и др.), причем в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах [7]. Данный факт стимулирует развитие методов нелинейной флуоресцентной спектроскопии для исследования изменения фотофизических^ параметров в системах взаимодействующих флуорофоров.
Ион уранила иОг2* - основная» форма-существования урана’(VI) в воде [2]. В растворах (в том числе в технологическом процессе выщелачивания урановых руд) уранил образует координационные соединения с анионами-лигандами, такими как Р\ БО*2’ и др. [8]. В результате присоединения лигандов спектральные и фотофизические характеристики уранила прегерпевают существенные изменения, в частности, значительно возрастает сечение люминесценции (произведение сечения поглощения и квантового выхода люминесценции) - наблюдается эффект «усиления люминесценции». Существует множество работ, ставящих своей целью объяснить и оценить количественно влияние лигандов на фотофизические параметры уранила [9-12]. Тем не менее, исчерпывающей теории этого процесса нет - более того, в литературе имеются взаимоисключающие точки зрения. Та же самая ситуация наблюдается и в изучении природы дезактивации возбужденного состояния иона уранила ис>22+ в водном растворе [4, 13-18], мультиплетности возбужденного состояния, ответственного за люминесценцию
6
[10, 19], природы скоростей релаксации высших возбужденных состояний [4, 20] и т.д. Для понимания механизмов изменения скоростей переходов и, как следствие, усиления люминесценции необходимо знание индивидуальных фотофизических параметров каждого комплекса, что в целом представляет непростую задачу: в большинстве случаев образец представляет собой смесь комплексов с неизвестными концентрациями. С исследованием индивидуальных фотофизических параметров комплексов уранила напрямую связана важная практическая задача разделения >флуоресцентных вкладов от физико-химических форм урана (комплексов с лигандами разного типа) в смеси с целью определения ее состава, что необходимо- для оптимизации процесса добычи урана* методом подземного выщелачивания [6].
Вторым классом исследовавшихся в диссертационной работе систем' были комплексы, образующиеся в результате связывания полиароматических углеводородов, ГГАУ (на примере пирена), молекулами гуминовых веществ (ГВ) - природных соединений, входящих в состав органического вещества почв, природных вод и твердых горючих ископаемых. В последние-годы активно изучается возможность использования ГВ в природоохранных технологиях в качестве природных детоксикантов [21-24]. Вопрос о механизме взаимодействия ГВ с ПАУ на настоящий момент является дискуссионным: большинство авторов придерживается мнения о гидрофобном механизме связывания [25], другие рассматривают связывание ПАУ гуминовыми веществами как распределение ПАУ между водной фазой и> мицеллоподобными структурами, образуемыми молекулами ГВ [26]. При этом предполагают, что ГВ способны образовывать, как меж-, так и внутримолекулярные мицеллоподобные структуры [27]. Необходимо отметить, что ГВ являются «молекулярной сборкой» - полидиспсрсной и гетерогенной структурой с неизвестным числом хромофоров/флуорофоров, что существенно затрудняет исследование их свойств [23].
В настоящее время основным методом исследования системы пирсн-ГВ является флуоресцентный анализ, например, эффективность связывания вычисляется из кривых тушения флуоресценции по уравнению Штерна-Фольмера [28]. Распространенность такого подхода объясняется его простотой, возможностью анализа in situ и чувствительностью. Обращает на себя внимание тот факт, что ряд наблюдаемых эффектов, например, изменение т.н. параметра полярности (величины отношения интенсивностей первого и третьего пиков в спектре флуоресценции пирена, чувствительной к характеристикам окружения молекулы [29]) при связывании ГВ,
7
необъяснимы в рамках предположения о статическом характере связывания, а данные разных групп о вкладе динамического механизма сильно разнятся [1]. При этом, насколько нам известно, в литературе не рассматривалась гипотеза о наличии переноса энергии возбужденного состояния в системе пирен-ГВ и не оценивался его вклад в динамическое тушение флуоресценции. Данное обстоятельство может быть вызвано, в том числе, тем, что при исследовании системы методами классической (линейной) флуориметрии в силу се особенностей факт наличия переноса энергии установить затруднительно.
Таким образом, обе поставленные в диссертации задачи объединены общностью проблемы установления механизмов влияния мсжмолскулярных взаимодействий на флуоресценцию флуорофоров (усиление или тушение флуоресценции) и предположением, что в решении этой проблемы большую роль может сыграть изучение влияния этих факторов на молекулярные фотофизические параметры флуорофоров. Это делает актуальным развитие новых подходов в флуориметрии, позволяющих определять возможно больший набор таких параметров для систем взаимодействующих флуорофоров. Разработка новых эффективных подходов к исследованию таких систем и методов их диагностики в условиях окружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладной задачей, в частности, представляют интерес для применений в экологии и для оптимизации технологических процессов.
Целью диссертационной работы являлось экспериментальное исследование влияния межмолекулярного взаимодействия на фотофизические параметры (в первую очередь — на скорости радиационной и безызлучателыюй дезактивации возбужденного состояния) комплексов, образующихся в результате взаимодействия пирсна с гуминовыми веществами и уранила с лигандами-анионами в воде. Поставленные задачи решались с использованием методов лазерной спектроскопии — нелинейной, кинетической и матричной флуориметрии.
В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
I. Разработать модели, описывающие флуоресцентный отклик смеси комплексов урана и системы пирен-ГВ как объекта с локализованной донорно-акцепторной парой в нелинейном режиме возбуждения.
8
2. Разработать алгоритм определения индивидуальных фотофизических параметров комплексов ураиила методами лазерной спектроскопии; разработать подход к определению парциальных концентраций комплексов урана в их смеси.
3. Выявить факторы, приводящие к увеличению сечения поглощения флуоресценции уранила при образовании им комплексов с лигандами-анионами (сульфатами и фторидами); исследовать корреляцию скоростей радиационной и безызлучательной дезактивации возбужденного состояния с параметрами комплексов и их окружения.
4. Исследовать взаимное влияние на фотофизические параметры молекул пиреиа и гуминовых веществ при их взаимодействии, оценить вклад механизма динамического тушения флуоресценции и проверить гипотезу о возможности переноса энергии электронного возбуждения в системе, представляющей из себя локализованную донорно-акцепторную пару.
Научная новизна работы.
Впервые совместно реализуемыми на одном лазерном спектрометре методами наносекундной кинетической и нелинейной флуоримстрии определены значения индивидуальных фотофизических параметров комплексов уранила с разным числом* лигандов и выявлена зависимость скоростей.радиационного и нерадиацнонного затухания от числа лигандов в комплексе.
Предложена и подтверждена* гипотеза о наличии переноса энергии электронного возбуждения в системе пирен-ГВ, приводящего к динамическому тушению флуоресценции пирена. Методом'нелинейной лазерной флуоримстрии, с использованием предложенного формализма коллективных состояний, определена скорость переноса энергии в системе.
Научная и практическая значимость работы определяю гея тем, что
1. Использование разработанных методик определения индивидуальных фотофизических параметров комплексов урана позволяет получать новую информацию о корреляции типа комплекса (числа лигандов в нем) и его фотофизических параметров, что представляет интерес для исследования механизмов усиления люминесценции при комплексообразовании.
2. Разработанный подход к определению парциальных концентраций физикохимических форм урана в смеси, основанный на методах лазерной флуоримстрии,
9
может использоваться для диагностики процесса добычи*урана методом подземного выщелачивания.
3. Предложенная методика анализа системы пирен-ГВ может быть использована для исследования характеристик процесса связывания в системе. Факт наличия переноса энергии-в системе объясняет ряд имеющихся в литературе противоречий (например, наблюдаемого изменения параметра полярности), а значения скорости переноса могут быть использованы для исследования структурных характеристик комплексов, образующихся при связывании.
Положения; выносимые на защиту..’
И Фотофизические процессы в системах, со счетным фиксированным числом флуорофоров (в том числе, идентичных) в нелинейном режиме возбуждения могут быть описаны с помощью формализма коллективных состояний групп флуорофоров, в частности, локализованных донорно-акцепторных.пар (ЛДАП)..
2. Кривые насыщения комплексов урана (VI) с лигандами-анионами при. возбуждении наносекундными импульсами могут быть описаны двумя параметрами: сечением поглощения*.и параметром, равным произведению времени жизни в возбужденном состоянии и константы скорости синглет-синглстной аннигиляции:;
3. Совместное применение методов ианосекундо!юй' кинетической и нелинейной флуориметрии позволяет одновременно определять индивидуальные фотофизические параметры (сечение поглощения, время; жизни- возбужденного^ состояния,, относительный квантовый выход флуоресценции) и, как ..следствие, парциальные концентрации комплексов урана (VI) с лигандами-анионами (фторидами, сульфатами); в их смеси в воде.- ■ ■ .
4. Из. анализа измеренных индивидуальных фотофизических параметров комплексов урана. (VI) следует, что увеличение сечения флуоресценции*, уранила при присоединении лигандов связано как с ростом радиационной, так и с падением нерадиационной скоростей релаксации возбужденного состояния.
5. В механизме тушения пнреиа при связывании его молекулами гуминовых веществ присутствует вклад динамического, тушения, связанного с переносом энергии возбужденного состояния пирена на хромофор ГВ. Данный факт проявляется в кривых насыщения их флуоресценции, из которых, с использованием модели коллективных состояний, может быть определена скорость переноса энергии.
10
- Київ+380960830922