Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом

2
СОДЕРЖАНИИ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных 11
1.2. Методы определения количества жизнеспособных бактерий 15
1.2.1. Прямые методы анализа жизнеспособности микробной культуры 16
1.2.2. Косвенные методы определения количества жизнеспособных микробных клеток 18
1.2.2.1. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люцифе-рин-люциферазной системы светляков 22
1.2.2.2. Применение люциферазы светляков для решения биоана-литических задач 23
1.2.2.3. Методология биолюминесцснтного определения количества микробных клеток 25
1.2.2.4. Подготовка образцов для определения АТФ 25
1.2.2.5. Методы экстракции внутриклеточного АТФ 25
1.2.2.6. Применение ЛТФ-метрии для контроля качества лиофили-зированных вакцин 28
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1. Материалы и методы 31
3
2.2. Методики проведения экспериментов 33
2.2.1. Определение оптической концентрации бактерий 33
2.2.2. Определение количества живых бактерий чашечным методом 34
2.2.3 Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом 34
2.2.3.1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ 34
2.2.3.2. Измерение биолюминесцентного сигнала 36
2.2.3.3. Расчет концентрации АТФ 36
2.2.3.4. Расчет количества жизнеспособных клеток по результатам биолюминесцентных измерений 37
2.2.3.5. Статистическая обработка результатов 37
2.3. Результаты собственных исследований 39
2.3.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции 39
2.3.2 Калибровка АТФ-реагента при использовании стандартных АТФ-расгворов 42
2.3.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси (реагент-испытуемый образец) 43
2.3.4. Изучение экстрагирующих свойств неонола-10 и влияния продолжительности экспозиции образца в экстрагенте на интенсивность биолюминесцентного сигнала 44
2.3.5. Определение возможности получения экстрактов лиофи-лизированной культуры бруцелл в ДМСО ^
2.3.6. Влияние длительности инкубирования водной суспензии бруцелл после восстановления лиофилизированной куль-
8
микробного (целевого) АТФ содержат внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию целевого на несколько порядков [104, 139]. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток и/или удаление из образца нецелевого АТФ. Методика пробоподготовки образца зависит от его состава, поэтому для конкретного образца очень важно подобрать и оптимизировать условия её проведения. От этого зависит возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах.
С учетом вышеизложенного, совершенствование процедуры определения количества жизнеспособных микробных клеток в бруцеллезных вакцинах представляется актуальной.
Цель работы. Разработка методики определения количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах, основанной на использовании биолюминесцентного метода.
Основные задачи исследования.
1. Оптимизировать порядок подготовки образцов нативных и лиофили-зированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ.
2. Установить оптимальные параметры определения количества живых микробных клеток в суспензиях нативных и лифилизированных культур бруцелл биолюминесцентным методом.
3. Провести сравнительное исследование методик определения живых бруцелл на основе биолюминесцентного и культурального методов с использованием коммерческих серий бруцеллезных вакцин.
4. Разработать методические рекомендации по определению количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах с использованием биолюминесцентного метода.
9
Научная новизна.
Впервые изучены и определены оптимальные параметры пробоподго-товки, установлены возможность и порядок определения количества живых бруцелл разных видов в составе бруцеллезных вакцин и бактерийных суспензий биолюминесцентным методом.
Практическая значимость.
Применение биолюминесцентпого метода для определения количества живых бруцелл позволяет:
- сократить время контроля выживаемости бруцеллезных вакцин в 5-10 раз, в сравнении с культуральным методом, исключив при этом использование питательных сред;
- значительно уменьшить контакт технического персонала биопредприятий с вакциной, предохранив его тем самым от сенсибилизации.
Апробация полученных результатов.
Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на 5-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006г.), конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.).
Полоэ/сения, выносимые на защиту:
- порядок подготовки образцов нативных и лиофилизированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ;
- порядок определения количества жизнеспособных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом;
- результаты сравнительного изучения выживаемости микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным и культуральным методами.