Адаптация вируса болезни Найроби к культурам клеток и его иммунобиологические свойства

2
СОДЕРЖАНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 5
1. ВВЕДЕНИЕ 7
1.1. Актуальность темы 7
1.2. Цель и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна работы 9
1.4. Практическая значимость работы 10
1.5. Основные положения выносимые на защиту 10
1.6. Личный вклад 11
1.7. Апробация и публикация результатов 11
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Общая характеристика болезни, экономический ущерб, 12 распространение и эпизоотологнческис данные
2.2. Таксономия вируса болезни Найроби 14
2.3. Структура вируса болезни Найроби 17
2.4. Устойчивость вируса в объектах внешней среды 19
2.5. Культивирование вируса болезни Найроби 20
2.6. Вирулентные свойства вируса болезни Найроби 24
2.6.1 Патогенез 24
2.6.2 Клинические признаки 24
2.6.3 Патологоанатомическис изменения 25
2.7. Антигенные свойства 28
2.8. Диагностика болезни Найроби и её дифференциация от других болезней 29
2.9. Средства специфической профилактики болезни Найроби 31
2.10. Меры борьбы 35
2.11. Заключение по обзору литературы 3 5
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 8
3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38
3.1.1 Материалы 38
3.1.1.1. Вирусы 38
3.1.1.2. Культуры клеток 38
3
3.1.1.3.Питательные среды, растворы и сыворотки 39
3.1.1.4. Реактивы 39
3.1.1.5. Оборудование 40
3.1.1.6. Подопытные животные 40
3.1.2 Методы исследований 41
3.1.2.1. Культивирование вируса болезни Найроби 41
3.1.2.2 Определение инфекционной активности вируса 41
3.1.2.3. Получение очищенного вируса болезни Найроби 41
3.1.2.4. Электронная микроскопия 42
3.1.2.5. Постановка реакции нейтрализации 42
3.1.2.6.Приготовление мазков крови и техника подсчета количества лейкоцитов 43
3.1.2.7. Определение стерильности штамма 44
3.1.2.8. Получение сывороток крови 44
3.1.2.9. Подготовка тест-препаратов для люминесцентной микроскопии 45
3.1.2.10. Получение ФИТЦ-иммуноглобулинов 46
3.1.2.11. Отработка режимов инактивации вируса болезни Найроби 47
3.1.2.12. Приготовление масляного адъюванта 47
3.1.2.13. Приготовление экспериментальных образцов инактивированной эмульгированной и ГОА - сапониновой вакцины 47
3.1.2.14. Определение безвредности 48
3.1.2.15. Изучение антигенной и иммуногенной активности 48
3.1.2.16. Анализ антигенов вируса болезни Найроби методом 48 иммуноблоттинга
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТ ВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 50
3.2.1. Адаптация штамма «ММ» вируса БН к первично-трипсинизированным и перевиваемым культурам клеток 50
3.2.2. Оптимизация условий выращивания культурального штамма вируса БН в культурах клеток ПС и ПО 55
3.2.2.1. Определение оптимальной множественности заражения 55
3.2.2.2. Влияние конце!прации сыворотки КРС на накопление вируса БН 57
10
иммуногенные свойства экспериментальных образцов ГОА-сапо ни новой и эмульгированной инактивированной вакцины против этой болезни.
1.4. Практическая значимость работы
1. Вакцинный культуральный штамм «ММ/К-05» вируса БН, полученный в перевиваемой культуре клеток ПС, депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв.№>2589).
2. Разработан роллерный метод культивирования вакцинного штамма «ММ/К-05» вируса БН, позволяющий получать в больших объемах вируссодержащее сырьё с инфекционной активностью - 6,5-7,0 ^ ТЦД5(/см3.
3. Культуральный вакцинный штамм «ММ/К-05» вируса БН отвечает требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, рекомендован для использования при разработке вакцинных и диагностических препаратов и применяется научными подразделениями института при проведении НИР по плану Россельхозакадемии.
4. Отработана схема получения специфической гипериммуиной сыворотки к вирусу БН на овцах. Полученная сыворотка с активностью в PH 1:2048 заложена в коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и используется при проведении НИР и диагностических исследованиях.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту
1. Адаптация мозгового штамма «ММ» вируса БН к первичным и перевиваемым культурам клеток животных различного происхождения и технологические параметры его культивирования в культурах клеток ПС и ПО;
2. Иммунобиологические характеристики штамма «ММ/К-05» вируса БН, полученного в культуре клеток ПС;
3. Схемы получения гипериммуиной специфической сыворотки к вирусу болезни Найроби для идентификации возбудителя и использования в диагностических исследованиях;
11
4. Результаты изучения экспериментальных образцов инактивированной теотропином ГОА-сапониновой и эмульгированной вакцины, полученной на основе культурального штамма «ММ/К-05» вируса ЬН.
1.6. Личный вклад
Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований проводились совместно с к.в.н., с.н.с. Жуковым А.Н. (раздел «Определение антигенной и иммуногенной активности»); к.б.н., с.н.с. Ногиной И.В. (раздел «Получение и оценка специфичности ФИТЦ-ИГ к вирусу БН»); к.б.н., с.н.с. Анохиной Е.Г. (раздел«Изучение иммунного ответа у животных с применением метода иммуноблоттинга»), д.б.н., Пономаревым В.Н. (исследование вируса с помощью электронной микроскопии в разделе «Адаптация штамма «ММ» к первично-трипсинизированным и перевиваемым культурам клеток»).
Диссертационная работа выполнена в ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ в 2004-2008гг. при проведении НИР по заданиям
01.02.03 и 08.01.03 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ и проекту РФФИ №07-04-13593.
1.7. Апробация работы и публикации по работе
Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на заседаниях ученого совета ПТУ ВНИИВВиМ в 2005-2007 гг.; международной научно-практической конференции ГНУ ВИЭВ, 2006г.; международной научно-практической конференции ВНИТИБП, 2006г.; конференции молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ», 2008г.
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них две статьи - в журналах по перечню ВАК: «Ветеринария», 2007 - № 2. - С. 16-19, и «Ветеринарная патология», 2007 - №4.- С.100-102.