ОГЛАВЛЕНИЕ
Принятые сокращения......................................... 6
Глава I. ВВЕДЕНИЕ......................................... 7
Глава II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................ 11
1.Алеутская болезнь норок ................................ 11
а) возбудитель АБН...................................... 11
б)структура генома вируса АБН .......................... 12
в)неструктурные белки вируса АБН ....................... 15
г)структурные белки вируса АБН ......................... 16
д)характеристика штаммов вируса АБН .............. 21
2.Пути распространения вируса АБН ........................ 23
3.Клинические формы и патологоанатомические изменения при АБН....................................................... 26
3.1.Алеутская болезнь новорожденных щенков .......... 26
3.2.Классическая форма АБН ............................. 29
4 . Иммунитет при АБН..................................... 32
5 . Профилактика АБН...................................... 36
6 . Диагностика АБН....................................... 37
Глаза III.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ....................... 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................ 4 3
1.МАТЕ РИАЛЫ.............................................. 4 3
1.1.Вирусы, бактериальные штаммы, плазмиды и питательные среды..................................................... 4 3
1.2.Реактивы ............................................. 43
1.3.Праймеры ............................................. 44
2. МЕТОДЫ................................................. 4 4
2.1.Выделение плазмидной ДНК щелочным методом .......... 44
2.2.Обработка ДНК рестрикционным эндонуклеазами .......... 46
2.3.Постановка полимеразой цепной реакции ................ 46
2.4.Электрофорез в агарозном геле ........................ 47
2.5.Очистка ПЦР-фрагментоз электрофорезом в агарозном геле...................................................... 4 7
2.6.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля .......... 47
2.7.Получение рекомбинантных молекул In vitro ............ 48
2.8.Приготовление компетентных клеток и трансформация их препаратами плазмидной ДКК ............................... 48
2.8.1.Подготовка компетентных клеток ................... 48
2.8.2.Электротрансформация ............................. 49
2.9.Выделение суммарной клеточной ДНК из органов животных(фенольный метод) ................................ 49
2.10.Клонирование ПЦР-продуктов .......................... 49
2.11.Кинирование ПЦР-продуктов ........................... 50
2.12.Достройка ПЦР-продуктов ............................. 50
2.13.Электофорез белков в ПААГ-ДСН ....................... 51
2.14.Окраска кумасси ..................................... 51
2.15.Методика постановки ПЦР-ИФА ......................... 51
2.15.1.Полимеразная цепная реакция ..................... 51
2.15.2.Подготовка полестероловых микроплашек для ПЦР-ИФА................................................... 52
2.15.3.Условия постановки ПЦР-ИФА ...................... 52
2 .16 . Постановка РИЭОФ на А5Н........................... 52
2.17.Определение активности термостабильной пирофосфатазы
(PPase) .................................................. 53
2.18.Экспрессия белков ................................... 54
2.19.Определение растворимости белка ..................... 54
2.20.Методика иммуноферментного анализа .................. 55
2.20.1.Сущность метода ................................. 55
2.20.2.Постановка реакции .............................. 55
2.20.2.1.Сенсибилизация планшетов ...................... 55
2.20.2.2.Внесение исследуемых сывороток и антивидзого конъюгата................................................. 55
2.20.2.3.Внесение субстрата и учет реакции ............. 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................. 57
ЧАСТЫ. Разработка ПЦР - диагностикума для обнаружения ДНК
вируса алеутской болезни норок ........................... 57
1.Получение ПЦР-продукта 715 ............................. 57
Глава I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
•
1.Алеутская болезнь норок.
Этиологическим агентом алеутской болезни у норок является вирус алеутской болезни норок. Вирус алеутской болезни норок - недефектный парвовирус (Bloom et al., 1980) приводит к развитию классической формы алеутской болезни, иммунного расстройства с персистирующей инфекцией в лимфоидных органах у взрослых норок (Aasted,1985; Porter, 1986; Alexandersen, 1990; Bloom et al., 1994). Иммунное расстройство характеризуется увеличением количества циркулирующих CD8+ лимфоцитов (Aasted,1989), плазмоцитозом, гипергаммаглобулинемией и иммунокомплексным заболеванием (Porter et al., 1983; Porter, 1986; Aasted, 1989; Alexandersen, 1990). При осаждении в почках иммунных комплексов развиваются артериты и гломерулонефриты (Porter et al., 1969, 1983; Porter, 1986) обычно заканчивающиеся
гибелью животных.
а)возбудитель АБН.
Вирус алеутской болезни норок относится к семейству Parvoviridae, подсемейство parvovirinae, род Parvovirus.
Помимо вируса алеутской болезни норок к роду Parvovirus относятся парвовирус собак(CPV), мелкий вирус мьсией (MVM) , вирус панлейкопении кошек (FPV), бычий парвовирус(BPV) , вирус энтерита норок(МЕУ) и др.
Вирус АБН автономный парвовирус, содержит одноцепочную линейную молекулу ДНК. Оболочка парзовируса -типичная икосаэдрическая частица, состоящая из 32 капсомерсв. Каждый капсомер состоит из 60 асимметричных белковых субъединиц (протомеров). Протомер включает в себя 10 белков VP1 и 50 белков VP2. (Рис 1).
Липидов, углеводов и ферментов в составе вирионоз не обнаружено. Молекулярная масса вирионоз около 7 КД. ДНК
АБН имеет молекулярную массу 1,4 МД, что составляет примерно 20% массы вириона. Коэффициент седиментации вируса AS 125S, плавучая плотность в хлористом цезии 1,41 - 1,43 г/мл (Bloom et al.,1980).
Рис.1 Компьютерная модель вируса алеутской болезни норок (Bloom,1999)
Частицы с плавучей плотностью более 1,43г/мл представляют собой плотные предшественники вирионов; вирионы с плазучей плотностью ниже 1,41г/мл вероятно дефектны. Плавучая плотность калсидов вируса АБН равна 1, 31г/мл.
Вирионы АБН стабильны при pH 3,0 - 9,0, прогревании при 5б°С в течение часа, устойчивы к жирорастворителям, трипсину, инактивируются ультрафиолетовыми излучением, производными этиленимина, гидроксиламином, а также окисляющими агентами (Аавбес!, 1983).
Вирус, содержащийся в гомогенате органов.
инактивируется 0,3% формалином з течение 48 часов при 37°С, но не инактивируется 0,4% формалином за 12 часов при 37°С.
б)структура генома вируса АБН.
- Київ+380960830922