Оглавление
Принятые сокращения............................................................2
Введение......................................................................3
Глава I. Объекты с локализованными допорно-акцепторными (ЛДА) парами
и их флуоресцентные свойства (обзор литературы)...............................10
Введение....................................................................10
1.1 Некоторые объекты с ЛДА парой...........................................11
1.1.1 Основные типы объектов с ЛДА парой..................................11
1.1.2 Применение искусственно созданных объектов с ЛДА парой..............13
1.1.3 Перспективы использования белков как объектов с ЛДА парой...........16
1.2 Собственная флуоресценция белковых молекул..............................17
1.2.1 Общие сведения о собственной флуоресценции белков...................17
1.2.2 Структура и спектральные свойства сывороточного альбумина человека (однотриптофановый белок) и бычьего сывороточного альбумина (двухтриптофановый белок)............................................21
1.2.3 Фотохимические реакции триптофана и триптофан-содержащих белков.... 24
1.3 Флуоресцентные белки....................................................26
1.3.1. Общие сведения о флуоресцентных белках (на примере зеленного - ОПР и красного - ОлЯес! флуоресцентного белка)..................................26
1.3.2 Посттрансляциопные формы флуоресцентных белков......................31
1.3.3 Мономерный аналог белка йзЯес! - белок тЯЛР!. Получение новых мутантов тЯЛР1................................................................35
Глава II. Определение фотофизических параметров ЛДА пар сложных органических соединений (теория)..............................................39
2.1 Модель фотофизических процессов в сложных органических соединениях 39 ■
2.2 Модель фотофизических процессов в ансамбле молекул с ЛДА парой..........47
2.3. Нелинейная и наносекундиаи кинетическая флуорнметрия ЛДА пар...........56
Глава III. Определение фотофизических параметров
флуорофоров/хромофоров в ЛДА парах (эксперимент)..............................65
3.1 Экспериментальная техника...............................................65
3.1.1 Наносекундный лазерный флуориметр/флорометр.........................65
3.1.2 Классические спектральные измерения.................................71
3.2 Определение фотофизических параметров триптофана в водном растворе 72
3.2.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции..........................72
3.2.2 Анализ кривых насыщения и кинетических кривых.......................74
3.3 Определение фотофизических параметров триптофан-содержащих белков (на примере человеческого и бычьего сывороточного альбумина) в водном растворе 77
3.3.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции..........................77
3.3.2 Ансишз кинетических кривых и кривых насыщения.......................80
3.4 Определение фотофизических параметров иодансамблей ЛДА пар на примере белка шКРР1..............................................................83
3.4.1 Анализ спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул белка тЯПР1.........................................84
3.4.2 Анализ воздействия лазерного излучения па ансамбль молекул белка тЯИР!.... 90
3.4.3 Определение концентраций и индивидуальных фотофизических параметров хромофора белка тЯПР1................................................97
3.4.4 Определение концентраций и фотофизических параметров флуоресцирующего хромофора белков тЯРР1/0668 и тЯПР1/(266С (мутанты белка тЯПР1).....104
3.4.5 Перенос энергии в ЛДА парах подансамблей белка тЯПР1...............107
Заключение..................................................................114
Список литературы............................................................116
оу
Принятые сокращения
В Blue form, синяя форма хромофора (белка);
FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer;
GFP - Green Fluorescent Protein;
G - Green form, зеленая форма хромофора (белка); mRFPl - monomeric Red Fluorescent Protein;
R - Red form, красная форма хромофора (белка);
Тф-триптофан;
Л - акцептор;
БСЛ - бычий сывороточный альбумин Д - донор;
ДА пара - донорно-акцепторная пара;
ЯДА пара - локализованная донорно-акцепторная пара;
ОМА - оптический многоканальный анализа гор;
КР - комбинационное рассеяние;
САЧ - сывороточный альбумин человека;
СОС - сложное органическое соединение;
ФБ - флуоресцентный белок.
2
Введение
Флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется в исследованиях сложных органических соединений (красителей, белков, фотосинтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.)- Однако традиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе флуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные [1]), поэтому данных, получаемых этими методами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации и диагностики сложного органического соединения (СОС). Задача диагностики СОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одного флуорофора.
Интересным и важным для практического применения подклассом многофлуорофорных систем являются молекулярные объекты с локализованной донорно-акцепторной (ЛДЛ) парой - макромолекулы, содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможен перенос энергии возбуждения. Объекты подобного рода играют большую роль в получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: их пространственной организации, размерах [2], состоянии микроокружения [1] и т.д., а также изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях [3]. В частности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей (меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основе так называемой «спектроскопической линейки» [4], используемой для измерения расстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения изменения конформаций, например, в белках [5], ДНК [6], полимерах [7). К объектам с ЛДЛ парой можно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорные красители [8].
Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДЛ парами являются их собственные флуорофоры. В этом случае не возникает проблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА) парам: неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток, стабильность комплекса молекула-метка и т.д. К числу таких объектов относятся многие типы белков. Их удобно использовать в качестве модельных объектов, содержащих локализованную пару флуорофоров. Но белки представляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компоненты живых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, что открывает возможность использования белков в качестве индикаторов процессов в живых системах.
3
При анализе белковой флуоресценции ограничения традиционной флуориметрии становятся особенно ощутимыми, т.к. флуоресценция белков может зависеть сразу от несколько факторов. Более того, белковая молекула часто изначально содержит несколько флуоресцирующих (и/или поглощающих, но не флуоресцирующих) центров, а препарат белка (ансамбль молекул) представляет собой смесь нескольких, спектрально неидентичных, подансамблей молекул белка [10,11]. Это приводит к тому, что получаемые традиционными флуоресцентными методами данные сложны для однозначной интерпретации и позволяют сделать, в основном, лишь качественные выводы о внутреннем состоянии объекта. Поэтому задача получения количественной информации in vivo, без каких-либо препаративных воздействий на объект, в ряде случаев не может быть решена методами классической флуориметрии.
Возможности флуоресцентного анализа СОС значительно расширяются с применением лазерных методов, которые в дополнение к традиционным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять молекулярные фотофизическис парамегры флуорофоров (время жизни, ссчснис поглощения, скорость межмолскулярно! о переноса энергии и др.) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах [12,13]. Эти параметры могут быть использованы в качестве диагностических признаков.
Разработка новых эффективных подходов к исследованию свойств многофлуорофорных объектов и методов их диагностики в условиях окружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладной задачей. Разрабатываемые применительно к белкам инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях и в перспективе, но-видимому, могут найти свои применения в практической медицине.
Пслыо работы является развитие новых подходов, которые открываются с применением к природным ансамблям с ЛДА парами лазерной флуориметрии — нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) и кинетической флуориметрии в нано- и субнаносекундно.м диапазонах.
В качестве объектов исследования были выбраны: белок бычий сывороточный альбумин (БСА), в каждой из молекул которого содержится пара природных флуорофоров - триптофановых остатков, и флуоресцентный белок mRFPl (monomeric Red Fluorescent Protein), в ансамбле молекул которого присутствуют три нодансамбля ЛДА пар. Предварительно методами лазерной флуориметрии были исследованы однофлуорофорные природные объекты: триптофан в воде и белок сывороточный
S
4
альбумин человека ((САЧ) каждая молекула которого содержит один триптофановый остаток).
В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
1. Построить модель, описывающую флуоресцентный отклик ансамблей ЛДА пар при их импульсном лазерном возбуждении.
2. Разработать основанный на совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии метод определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА парах.
3. Апробировать методы лазерной флуориметрии на однофлуорофорных объектах и получить фотофизические параметры их флуорофоров.
4. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного моноансамбля с ЛДА парой (двухтриптофановом белке - БСА): получить кривые насыщения и кинетики флуоресценции, определить из них индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии между ними (с возбужденной молекулы донора как па невозбужденную, так и на возбужденную молекулу акцептора).
5. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного объекта (флуоресцентного белка), ансамбль молекул которого является совокупностью нескольких (грех) подансамблсй с ЛДА парой: получить кривые насыщения флуоресценции, определить долю каждого подансамбля в общем ансамбле, определить индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии в локализованной паре для каждого подансамбля.
Содержание диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы.
Во введении обосновывается актуальность темы диссертации, формулируются цель и задачи исследований, приводятся положения, выносимые на защиту, кратко излагается содержание диссертации.
В первой главе дан анализ литературы, посвященной применению флуоресцентной спектроскопии для исследования и диагностики ансамблей ЛДА пар. Особое внимание уделено флуориметрии белков. В первой части главы описываются основные типы (искусственно созданные и природные), свойства и области применения объектов, содержащих ЛДА пару. Приводятся примеры объектов с ЛДА парой,
5
рассматриваются примеры изучения структурной организации органических соединений с использованием искусственных ЛДЛ пар, отмечаются основные трудности, которые возникают при этом. Во второй части главы представлены общие сведения о собственной флуоресценции белков. Даны сведения о флуоресцентных свойствах и структуре белков сывороточный альбумин человека (САЧ) и бычий сывороточный альбумин (БСА). Отмечено, что белок БСА является представителем широкою класса объектов -природных макромолекул, содержащих ЛДЛ пару флуорофоров. Рассмотрены фотохимические процессы, которые возникают в молекулах свободного триптофана и триптофан-содержащих белков при воздействии на них УФ света. В третей части главы представлены сведения об особом классе белков - флуоресцентных белках (ФБ), на примере зеленного (GFP) и красного (DsRcd) флуоресцентного белка, представлены их спектральные свойства и структурная организация. Описан процесс формирования флуорофора ФБ. Указано, что каждая мономерная субъединица молекулы этих белков содержит ЛДЛ пару, а ансамбль молекул ФБ является совокупностью нескольких неэквивалентных лодансамблей молекул, содержащих ЛДА пару
Вторая глава посвящена созданию модели, описывающей кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющей рассчитывать флуоресцентный отклик ансамбля локализованных ДА пар при его лазерном возбуждении. В первой части главы на основе литературных данных приведена необходимая для изложения оригинальных результатов информация о флуоресценции СОС. Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика СОС для случая двухкомпонентной смеси однофлуорофорных молекул СОС такой, что между компонентами возможен межмолекулярный перенос энергии. Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика в случае слабоконцентрированного однофлуорофорного раствора СОС со спецификой, свойственной водному раствору триптофана. Во второй части главы разрабатывается модель, описывающая флуоресцентный отклик ансамбля ЛДА пар (в предположении, что возбуждение происходит наносекундными импульсами лазерного излучения) с учетом переноса энергии с возбужденного донора на: а) невозбужденный акцептор; б) возбужденный акцептор (синглег-синглетная аннигиляция). В третий части главы рассматриваются теоретические основы методов нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии СОС при их возбуждении наносекундными лазерными импульсами. Приводятся алгоритмы решения обратных задач кинетической и нелинейной флуориметрии, результатом применения которых является определение молекулярных фотофизических параметров
флуорофоров СОС (сечения поглощения, скорости внутри- и межмолекулярного переноса энергии и др.) из кривых насыщения флуоресценции и кинетических кривых.
Третьи глава посвящена экспериментальному определению фотофизических параметров природных макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару, методами лазерной флуоримстрии. В качестве объектов исследования были выбраны белок бычий сывороточный альбумин и флуоресцентный белок тКРР1. Каждая молекула этих белков содержит ЛДА пару, причем ансамбль последнего представляет собой смесь нескольких неидентичных подансамблей молекул, содержащих ЛДА мару. Предварительно методы лазерной флуориметрии были апробированы, на однофлуорофорных природных соединениях: триптофане в водном растворе и белке сывороточный альбумин человека. Первая часть главы посвящена описанию характеристик универсального лазерного флуоримстра/флуорометра, позволяющего реализовывать нелинейную и кинетическую флуориметрию. Во второй части главы определяются фотофизические параметры молекул триптофана в слабоконцентрированном водном растворе при возбуждении импульсами лазерного излучения с длиной волны 266 нм. Третья часть главы посвящена определению фотофизических параметров триптофаи-содсржащих белков, таких как сывороточный альбумин человека и бычий сывороточный альбумин в водном растворе, методами лазерной флуориметрии. Последний является представителем широкого класса объектов -макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцеи горную пару. В четвертой части главы описан основанный на лазерной флуориметрии (совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии) комплексный метод определения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров подансамблей ЛДА пар флуоресцентных белков, /(ля белка гпЯ1;Р1 как представителя природных объектов с ЛДА парами установлена схема фотофизических процессов и определены: доля молекул каждого подансамбля ЛДА пар в конечном препарате белка, фотофизические параметры ЛДА пар.
Научная новизна
Предложена модель фотофизических процессов в молекулярных объектах с ЛДА парой, адекватно описывающая флуоресцентный отклик флуорофоров при возбуждении импульсами лазерного излучения. Введено понятие коллективных состояний ЛДА пары. Предложена модель, описывающая кинетику населенностей этих состояний и
7
позволяющая рассчитать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамбля ЛДА пар.
Впервые совместно реализуемыми на одном лазерном спектрометре методами паносекундной кинетической и нелинейной флуориметрии определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров белков mRFPl, бычьего сывороточного альбумина и сывороточного альбумина человека. Для первых двух, на основе предложенной модели, впервые определена константа переноса энергии между флуорофорами. Для mRFPl определены парциальные концентрации посттрансляционных форм белка.
Научная и практическая значимость
Предложенная методика определения фотофизических параметров, в частности, скорости переноса энергии в природных системах с ЛДА парами открывает новые возможности использования их в качестве сенсоров в живых организмах. Определение индивидуальных фотофизических параметров молекул каждого из подансамблей флуоресцентных белков может быть применено для контроля свойств получаемых флуоресцентных белков. Развитый подход, основанный на измерении фотофизических параметров флуорофоров белков in vivo, может применяться для изучения процессов в живых системах, а значения фотофизических параметров, полученные для конкретных объектов, использованных в работе - для диагностики конкретных биологических систем, содержащих эти белки.
Положения, выносимые на защиту
]. Совместное применение наносекундиой кинетической и нелинейной лазерной флуориметрии позволяет одновременно определять значения всех основных фотофизических параметров молекул триптофана в воде (сечения поглощения в основном и возбужденном синглстном состояниях; время жизни возбужденного состояния; сумма скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния) и триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека (сечение поглощения; время жизни возбужденного состояния; скорость интеркомбинационной конверсии).
8
2. Разработанная модель коллективных состояний локализованной донорно-акцепторнон (ЛДА) пары позволяет описать флуоресцентный отклик ансамбля ЛДА нар при лазерном возбуждении.
3. Разработанным методом, использующим нелинейную и кинетическую лазерную флуориметрию, по предложенной модели коллективных состояний ЛДА пары, могут быть определены значения индивидуальных фотофизичсских параметров ее флуорофоров, в частности, значения фотофизичсских параметров (сечения поглощения и времена жизни донора и акцептора пары; скорость переноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный и возбужденный акцептор) флуорофоров белков mRFPl и бычий сывороточный альбумин, которые являются представителями природных объектов с ЛДА нарой. Для белка mRFPl может быть определена доля молекул каждого подансамбля в общей смеси трех типов ЛДА пар.
Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на следующих конференциях: IV Всероссийская конференция “Физические проблемы экологии (Экологическая физика)” (Москва, июнь, 2004); Международная конференция “Opto-Ircland 2005” (Дублин, апрель, 2005); IV Международная конференция молодых ученых и специалистов “Оптика-2005” (Санкт-Питербург, октябрь, 2005); II Троицкая конференция. Медицинская физика и инновации в медицине (Троицк, май, 2006); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2006” (Москва, апрель, 2006); Международная конференция “Lasers, Applications and Technologies (I AT 2007)” (Минск, май-июнь, 2007); Международная конференция “Laser Applications in Life Sciences (LALS 2007)” (Москва, июнь, 2007).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 8 статей [13,85,87,92,93,94,116,123], 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК России [13,85,92,93], и 6 тезисов докладов на конференциях [95,97,111,112,113,122].
9
- Київ+380960830922