РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Етапи проведення досліджень та об'єкти
Дослідження розподіляли на два етапи. На першому етапі роботи проводили дослідження in vitro на високоочищених препаратах ароматази. Сюди входили дослідження механізму активації кисню ароматазой, а також вивчення впливу відновлювачів-антиоксидантів (аскорбінової кислоти, глутатіону-SH, цистеїну та гідрохінону), глюкокортикоїдів (кортизолу), ксено- (ДДТ, ДДЕ) та фітоестрогенів (геністеїн), а також флавоноїдів (кверцетин) на її каталітичну активність. На цьому ж етапі вивчали вплив ксено- та фітоестрогенів (ДДТ та геністеїн) на активність синтази оксиду азоту в дослідах in vitro. На другому етапі вивчали вплив аскорбінової кислоти, кортизолу, ДДТ, геністеїну та кверцетину на активність ароматази та утворення естрогенів in vivo. Крім того вивчали активність ароматази та синтази оксиду азоту за умов оксидативного стресу, індукованого хлоридом кобальту.
Для досліджень in vitro були отримані високоочищені препарати цитохрому Р450 ароматази. Об'єктом для виділення та очищення ароматази була матка щурів лінії Вістар, тому що в цьому органі спостерігається досить висока питома активність ферменту. Для досліджень in vivo були використані щури цієї ж лінії. Крім того, досліджували активність ароматази в плаценті та вміст естрогенів у сироватці крові людей, що мешкають у регіонах, забруднених ксеноестрогенами (ДДТ, ДДД, ДДЕ та нітрофеном).
2.2. Виділення та очищення цитохрому Р450 ароматази з матки щурів
Нами був розроблений метод очищення цитохрому Р450 ароматази, що дозволяє отримати високоочищений, практично гомогенний препарат з високим виходом ферменту в ньому. Для отримання кожного препарату використовували матку 10 щурів-самиць лінії Вістар у віці 6 - 7 місяців та вагою 250 ( 30 г.
Принцип методу. Метод оснований на виділенні мікросом з біологічної тканини, екстракції ферментів з них за допомогою холату натрію, осадженні цитохрому Р450 ароматази охолодженим ацетоном з послідуючим афінним осадженням ферменту на агарозі, до якої ковалентно приєднували 17-метилтестостерон чи тестостерон (субстрати ароматази) через спейсер - янтарну кислоту (рис. 2.1), та його елюцією.
Рис. 2.1. Агароза, ковалентно зв'язана з 17-метилтестостероном
Реагенти
1) Цукроза (Реахім, ч. д. а. або х. ч.), 0,25 М водний розчин.
2) Холева кислота (Reanal, хроматографічно гомогенна - х/г), 1 % розчин у 1 % водному розчині NaOH (Реахім, х. ч.). Холева кислота при розчиненні в надлишку гідроксиду натрію повністю перетворюється на холат натрію.
3) Ацетон (Реахім, х. ч. чи purissimus).
4) Агароза сферична (Sigma).
5) Янтарна кислота (Реахім, х. ч.), 22 мМ розчин у воді.
6) 17-метилтестостерон чи тестостерон (Sigma), 20 мМ розчин у 96 % етанолі.
7) Сірчана кислота, концентрована (Реахім, х. ч.).
8) Трис-НСl буфер (використовували трис фірми Reanal та соляну кислоту заводу Реахім), 0,1 М, рН 7,4.
9) Трис-НСl буфер (використовували трис фірми Reanal та соляну кислоту заводу Реахім), 0,1 М, який містив 1 М NaCl (Реахім, ч. д. а.), рН 8,0.
10) NaCl (Реахім, ч. д. а.), 1 М водний розчин.
*Для приготування реагентів використовували бідистильовану воду.
Проведення очищення
1) Приєднання 17-метилтестостерону (тестостерону) до агарози. По-перше здійснювали ковалентне приєднання субстрату до спейсеру. Для цього змішували 1,0 мл 20 мМ 17-метилтестостерону (чи тестостерону), 0,9 мл 22 мМ янтарної кислоти та 0,1 мл концентрованої сірчаної кислоти. Суміш інкубували 30 - 60 хвилин при t? 50 - 60 ?C. Після цього до отриманого монозаміщеного янтарного ефіру 17-метилтестостерону (тестостерону) додавали 200 мг агарози та залишали на 30 - 60 хвилин при t? 50 ?C. Далі отриманий гель відмивали 1 М розчином NaCl, а потім бідистильованою водою, суспендували в 0,1 М трис-HCl - буфері (рН 7,4) із розрахунку 50 мг/мл та використовували для афінного осадження ферменту.
2) Очищення ферменту. Матку декапітованих тварин одразу гомогенізували у чотирьохкратному об'ємі 0,25 М водного розчину цукрози [41]. Гомогенат центрифугували протягом 30 хвилин при 20 000 g. Осад вилучали, а до супернатанту, що вміщував мікросоми, додавали рівний об'єм розчину холату натрію та залишали у спокої на 15 - 30 хвилин для екстракції мікросомальних білків [136]. Далі до екстракту білків додавали охолоджений до - 18 ?C ацетон (приблизно 2-кратний об'єм - до виникнення чіткого осаду) та залишали у спокої на 15 хвилин, після чого центрифугували 15 хвилин при 10 000 g. Супернатант вилучали, а осад розчиняли у бідистильованій воді із розрахунку 10 - 12 мг білку на 1 мл. До отриманого розчину додавали рівний об'єм суспензії гелю агарози, до якої був приєднаний субстрат. Інкубували протягом 5 хвилин при t? 38 ?C, безперервно перемішуючи, після чого центрифугували 5 хвилин при 10 000 g. Супернатант вилучали, а осад елюювали 0,1 М Трис-НСl буфером, рН 8,0, який містив 1 М NaCl. Елюат використовували у якості ферментного препарату. Метод захищений патентом України [39].
Під час очищення ферменту на кожній стадії визначали вміст білку за методом Лоурі та активність ферменту за методом, який описано нижче.
Чистоту ферменту контролювали за допомогою диск-електрофорезу в 7,5 % поліакріламідному гелі (ПААГ) з використанням трис-гліцинового електродного буферу (pH 8,3) [38]. Електрофорез проводили протягом 2 - 3 годин при силі струму 14 мА та напрузі 200 - 250 V. Стовпчики гелю по закінченні електрофорезу фарбували 0,04 % розчином кумассі діамантового голубого (coumassi brilliant blue) у 3,5 % водному розчині хлорної кислоти. Полоси елюювали 5 % СН3СООН та визначали екстинкцію на спектрофотометрі при 680 нм.
2.3. Дослідження активності цитохрому Р450 ароматази у ферментних препаратах та гомогенатах тваринних тканин
Для дослідження каталітичної активності ароматази були модифіковані існуючі методи визначення її активності [143, 183]. Розроблений метод використовували для вивчення кінетики аромат