РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Штами, середовища, умови культивування
В роботі використано 137 штамів E. carotovora, представлених згідно [119] двома підвидами: carotovora і atroseptica. Серед 114 штамів E. carotovora subsp. carotovora 64 штами були ідентифіковані при виділенні як E. carotovora, 2 штами як E. carotovora f. zeae, 48 штамів як E. aroideae. Для зручності при порівнянні даних, а також враховуючи значну чисельність і відокремленість останніх [18], в подальшому ми використовували для них назву E. aroideae. Серед 23 штамів Е. carotovora subsp. atrosepticа 16 штамів були ідентифіковані при виділенні як E. atroseptica, 7 штамів ? як E. phytophthora.
Культури отримано з різних колекцій. Штами були вилучені у різний час із різних рослин-хазяїв та в різних регіонах світу. Як при виділенні, так і згідно з нашими щорічними дослідженнями протягом п'яти років, штами відрізнялись між собою за вірулентністю та протопектиназною активністю (табл. 2.1).
Для порівняння використовували типовий штам родини Enterobacteriaceaе ? E. coli 8991Т (CCM 5172T =ATCC 11775T), отриманий від M. Kocur (Чеська колекція мікроорганізмів, Університет м. Брно), типовий штам роду Erwinia ? Е. amylovora 2024Т (ATCC 15580Т=NCPPB 683Т), отриманий від J. De Ley (Рійкський університет, Бельгія), а також типові штами підвидів: Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т (NCPPB 549T=ATCC 33260T), отриманий від J. De Ley (Рійкський університет, Бельгія), Е. carotovora subsp. betavasculorum 4226T (ICPB 4226T=ATCC 43762T), отриманий з ICPB (Нова Зеландія), Е. carotovora subsp. odorifera 1878T (CFBP 1878T=NCPPB 3839T), отриманий від R. Samson (Франція).
Для вивчення залежності між хімічним складом ЛПС E. carotovora та вірулентністю цих пектолітичних бактерій використовували штам Е. carotovora subsp. atroseptica 36А та його мутанти, резистентні до налідіксової кислоти, ? вірулентний Nal 4 і авірулентний 544, який не виділяє целюлазу і пектатліазу, люб'язно надані Ю.К. Фомічовим (БДУ, Мінськ, Білорусь).
Таблиця 2.1.
Перелік штамів Erwinia carotovora
Номер штамуНазва, дана при виділенніРослина-хазяїнЗвідки отримано штамиПротопек-тинази та вірулент-ність123451A, 2A, 3A, 9B, 17A, 19A, 20A, 23A, 24A, 28A, 47AEarSolanum tuberosum7+4A, 5A, 22A, 25A, 31A, 32A, 33A, 35A, 40A, 42A, 50A, 53AEcar7+2054=8351*, 2146=8352*, 613=8923*8+1008=8982Т*2+72013?21A, 22A, 27A, 30A, 36A, 37A, 39A, 67A, 68AEatr7+G110=8445*, HTI=8476*, SR2/2=8446*, 322=8983*, SR1, G1255+363+34=8349*, 9Ф=8912*, 11 Ф=8913*Ephyt8+7200, 84913+9=8887*13+
Продовження таблиці 2.1.
123455П, 29П, 48П, 50П, 53П, 60П, 111ПEcarIris sp.1+1011=8988*2+73, 329, 332, 482, 635e, 562=8941*, 74=8942*, 915=8943*, 624a=9844*, 576=8948*, 878=8949*EarCalla aethiopica3+27П, 46П, 59П, 88П, 91ПEcarHyacinthus orientalis1+1012=8989*2+178, 741, 743, 808, 890, 173=8945*, 184=8946*, 300E=8947*Ear3+56=8907*EcarZea mays4+1065=8447*, 147=8448*Ezea5+1009=8987*EcarCucumis sativus2+1959=8604*Ear6+216, 258=8883*EcarBrassica oleraceae9+71=8893*, 133=8895*, 185=8896*, 135=8897*, 92=8898*, 106=8899*, 5=8900*, 180=8905*4+4383?67, 75, 246=8884*, 301=8885*, 75=8886*Ear9+144a3+
Продовження таблиці 2.1.
123456A, 49A, 55AEcarDaucus sativus R.7+927=8639*, 495=8906*4+92110+718=8635*, 766=8636*Ear4+1956=7869*EarLycopersicum esculentum3+550=8458*EarNicotinia tabacum5+650=8984*2+966=8985*EarPersica vulgaris2+301=8591*Ecarплодові дерева3?7136, 7502a, 7509a, 7511, 7515a, 7565b, 7638EcarTrifolium sp.3?1006a=8527*EcarLupinus polyphyllus3?8449EphytPhaseolus vulgaris3?3=8472*Ecitrрвотні маси людини11?G123=8477*, T2=8478*, G117=8479*Ecarдані невідомі5+119V=8457*, 911V=8480*, G173=8481*, G115=8482*Ear5+111=8634*, EA1443+566BKMB=8667*12+ Примітки: *? номер культури в колекції фітопатогенних бактерій ІМВ НАНУ. В другій колонці: Ecar ? E. carotovora, Ear ? E. aroideae, Eatr ? E. atroseptica, Ephyt ? E. phytophthora, Ecitr ? E. carotovora var. citrullis, Ezea ? E. carotovora f. zeae. В четвертій колонці цифри означають наступне: 1 ? ботанічний сад, Москва; 2 ? Чеська колекція мікроорганізмів, Брно; 3 ? Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ; 4 ? НДІ сільськогосподарської мікробіології, Росія; 5 ? Інститут біології, Румунія, Бухарест; 6 ? Інститут рослиноводства, Росія; 7 ? Білоруський Державний університет, Мінськ; 8 ? НДІ картопляного господарства, Росія; 9 ? НДІ фітопатології, Росія, Москва; 10 ? Інститут мікробіології, Вірменія, Єреван; 11 ? Саратовський університет, Росія; 12 ? Інститут мікробіології, Росія, Москва; 13 ? дані відсутні. У п'ятій колонці: "+" наявність ознаки, "?" відсутність ознаки.
У роботі використано макромолекулярні каротоворицини E. carotovora subsp. carotovora, люб'язно надані Ф.І. Товкачем (ІМВ НАНУ): Еar24A, Еса7А, Еса13А, Еса15А, Eca31A, Eca42A, Eca43A, Eca48A, Eca50A, Eca53A, Eca54A, Eca55A, Eca59A, Eca66A, Eca69A, Eca216, EcaJ2, Ecaj13, EspZM-1.
Бактерії вирощували на картопляному агарі при 28 ?С, клітини збирали у фазі логарифмічного росту культури (18?20 год). Бактеріальну масу змивали і двічі відмивали від ендогенних субстратів фізіологічним розчином, відділяли центрифугуванням (10 000 g, 40 хв).
2.2. Визначення вірулентних властивостей та протопектиназної активності бактерій.
Про протопектиназну активність судили по здатності бактерій мацерувати скибки картоплі в лабораторних умовах (біологічна проба). Вірулентні властивості вивчали щорічно протягом п'яти років методом штучного зараження індикаторної рослини ? зелених плодів томатів у польових умовах та по здатності мацерувати бульби картоплі [1].
2.3. Визначення моносахаридного складу клітин.
При визначенні моносахаридного складу клітин, осаджені центрифугуванням клітини гідролізували 1М H2SO4, або 3