РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились в Институте педиатрии, акушерства и гинекологии АМН Украины и ОООФ "О.Д.-Пролисок".
Объектами исследований служили чистые культуры микроорганизмов родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus и Acetobacter, выделенные из различных природных источников, в том числе из биотопов здоровых людей, а также ассоциативные культуры этих микроорганизмов.
2.1. Питательные среды
При проведении исследований молочнокислых бактерий родов Lactobacillus, Lactococcus и Streptococcus использовались следующие питательные среды:
• стерилизованное обезжиренное молоко;
• молоко, гидролизованное панкреатином, в разведении водой в соотношении 1:2, рН после стерилизации 6,8-7,0 [17];
• агар с гидролизованным молоком;
• среда MRS (Sigma);
• среда М-17 (Sigma);
• агар с гидролизованным молоком, сахарозой, дрожжевым автолизатом и лимоннокислым кальцием [17] - для определения ароматообразующих бактерий;
• среда Гисса для изучения спектра ферментируемых углеводов.
Для изоляции и изучения бифидобактерий использовали жидкую или агаризованную среду Blaurock (Sigma);
Выделение чистых культур и изучение свойств пропионовокислых бактерий проводили с использованием среды Blaurock (Sigma) и специально подобранной среды следующего состава: пептон (5 %), лактат натрия (4 %), дрожжевой экстракт (2 %), рН 6,5-7,0.
Уксуснокислые бактерии изучали с использованием гидролизованного молока, подкисленного молочной кислотой до рН 4,0-4,5.
Исследуемые культуры лактобацилл и лактококков поддерживали периодическими перевивками в стерилизованное обезжиренное молоко или среду MRS, бифидобактерии - в среду Blaurock, пропионовокислые бактерии - в пептоново-лактатную среду, уксуснокислые бактерии - в гидролизованное молоко (рН 4,0). Периодичность перевивок - 30-40 сут. Инкубирование проводили при оптимальной температуре роста. Хранили культуры в условиях холодильника (температура 4-6 оС).
2.2. Методы исследований
Идентификацию исследуемых штаммов проводили согласно определителю Bergey`s [349], а также по описаниям и характеристикам других авторов [17, 66, 110, 111, 150, 174, 268].
Все используемые в работе штаммы оценивались по следующим показателям:
• морфологии клеток и колоний;
• окраске по Граму;
• отношению к кислороду;
• редуцирующей способности;
• отношению к температуре и кислотности среды;
• резистентности к антибиотикам;
• сбраживанию и окислению органических субстратов;
• ауксотрофности по отношению к витаминам и аминокислотам;
• синтезу четырехуглеродистых ароматических соединений и углекислого газа;
• кислотонакоплению в молоке и других органических средах;
• резистентности к желчи, фенолу, хлористому натрию, желудочному соку, лизоциму;
• протеолитической активности;
• синтезу внеклеточных полисахаридв;
• антагонистическим свойствам;
• адгезивной способности.
Созданные в процессе работы пробиотические и заквасочные бактериальные препараты изучали по нижеперечисленным свойствам:
• микроскопическому препарату;
• уровню клеточных популяций;
• молокосвертывающей активности;
• кислотонакоплению в различных питательных средах;
• синтезу ароматических метаболитов;
• синтезу внеклеточных полисахаридов;
• протеолитической активности;
• антагонистическим свойствам;
• адгезивной способности;
• синтезу витаминов;
• резистентности к антибиотикам, лизоциму, желчи, фенолу, желудочному соку.
Морфологию клеток и колоний отдельных штаммов изучали при инкубировании их в различных питательных средах.
Редуцирующие свойства сахаролитических бактерий определяли в обезжиренном молоке с разным содержанием метиленового голубого (от 0,01 до 0,001 %). Редуцирующую активность оценивали визуально по скорости восстановления метиленового голубого, что сопровождается обесцвечиванием среды.
Резистентность к антибиотикам лактобацилл, лактококков, уксуснокислых бактерий и симбиотических культур осуществляли диско-диффузионным методом. На поверхность плотной среды MRS в чашках Петри засевали бактериальную суспензию плотностью 109 КОЕ/см3, чашки подсушивали в термостате и на поверхность среды помещали диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при оптимальной температуре роста исследуемого штамма или симбиоза в течение 48 ч. Резистентность к антибиотикам оценивали по диаметру зоны задержки роста.
Резистентность к антибиотикам бифидобактерий и пропионовокислых бактерий определяли в жидкой среде Blaurock, в которую добавляли различные концентрации коммерческих препаратов антибиотиков и инокулят штамма из расчета получения стартовой концентрации клеток в среде 108 КОЕ/см3. Посевы инкубировали при оптимальной температуре роста в течение 8 ч. Контроль роста осуществлялся с интервалом 1 ч и сравнивался с ростом культуры в контрольном варианте (без добавления антибиотика).
Резистентность к фенолу определяли в среде MRS (при исследовании лактобацилл и лактококков) или среде Blaurock (при исследовании пропионовокислых или бифидобактерий). В среду добавляли различные количества 8%-го стерильного водного раствора фенола. Пробирки со средой тщательно встряхивали и засевали 5 % соответствующей культуры. Посевы инкубировали при оптимальной температуре роста в течение 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечали визуально и определяли концентрацию клеток, сохранивших жизнеспособность.
Резистентность к желчи определяли в вышеперечисленных питательных средах, в которые добавляли 20, 30 и 40 % желчи. Посевы выдерживали в термостате в течение 48 ч при оптимальной температуре роста. Рост или отсутствие роста культуры отмечали визуально и определяли концентрацию выживших клеток.
Для оценки резистентности штаммов и симбиозов к желудочному соку, культуры наращивал