РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Об’єкт та матеріали дослідження
Об’єктом дослідження були 112 штамів токсиноутворюючих коринебактерій:
Corynebacterium diphtheriae gravis токсигенний (C.d.gravis tox+) - 60 штамів,
Corynebacterium diphtheriae mitis токсигенний (C.d.mitis tox+) - 36 штамів,
Corynebacterium diphtheriae belfanti токсигенний (C.d.belfanti tox+) - 11
штамів, Corynebacterium ulcerans токсигенний (C.ulcerans tox+) - 5 штамів;
музейні та вилучені від хворих та здорових носіїв у період 2000-2005рр. (м.
Харків)
Виділення мікробів проводили у відповідності з Наказом №192 від 03.08.1999 р.
МОЗ України. Ідентифікацію коринебактерій здійснювали за допомогою
мікротест-систем ММТ D (PLIVA-Lachema а.s., Чехія).
Спектрофотометричні вимірювання проводили на “Specord uv vis” (Німеччина) при
30 0С.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Фізичні методи
Джерелами мікрохвильового випромінювання служили стандартні високочастотні
генератори Г4-141 і Г4-142 з діапазоном частот для Г4-141: f1=37,5-53,57 ГГц;
для Г4-142: f2=53,57-78,33 ГГц та середньою щільністю потоку потужності енергії
- 0,1 мВт/см2.
У якості фактору ушкодження мікробних клітин використовували ртутно-кварцеву
лампу ПРК-4, яка забезпечує діапазон ультрафіолетового опромінення (УФО,
л=240-578 нм).
Усі використані в дослідах прилади фізичних індукторів були надані Інститутом
радіофізики і електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України згідно з “Договором о
научно-техническом сотрудничестве между Институтом радиофизики и электроники
им. А.Я. Усикова НАН Украины и Институтом микробиологии и иммунологии им. И.И.
Мечникова АМН Украины” від 31 жовтня 2003 р., та пройшли відповідну
метрологічну повірку, на підставі чого були акредитовані (атестат акредитації №
100-1573/2004, дійсний до 25.11.2007 р., виданий Державним комітетом України з
питань технічного регулювання та споживчої політики).
2.2.2 Бактеріологічні методи
Вилучення та ідентифікація мікроорганізмів. Мікробіологічне обстеження здорових
бактеріоносіїв проводили відповідно методичним вказівкам до Наказу МОЗ України
№ 192 „Про заходи щодо покращення бактеріологічної діагностики дифтерії в
Україні” [208].
Для ідентифікації вилучених культур мікроорганізмів використовували набори та
окремі тести виробництва PLIVA-Lachema а.s., Чехія; НИЦФ, Санкт-Петербург,
Росія та bioMerieux, Франція.
При дослідженні користувались елективними та диференціально-діагностичними
середовищами, більшість з яких була виробництва „Государственный научный центр
прикладной микробиологии, отделение „Питательные среды” МЗРФ (г. Оболенск
Московской обл., РФ)”, НВО „Питательные среды” (г. Махачкала, РФ),
„Национальный научно-производственный центр генно-инженерных препаратов (г.
Оболенск Московской обл., РФ)”, Дослідне виробництво бактеріальних заквасок
Технологічного інституту молока та м’яса ААН України (м. Київ). Приготування
поживних середовищ здійснювалось відповідно ГОСТу 10.444. 1 – 84 (СТСЭВ 3833 –
82) „Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных
сред, применяемых в микробиологическом анализе” [209].
Контроль якості поживних середовищ проводили за рекомендаціями фірм-виробників,
які викладено у сертифікатах до продукції, а також за Інформаційним листом МОЗ
України №05.4.1/1670 „Бактеріологічний контроль поживних середовищ”, Київ,
2000.
Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних
клітин проводили за допомогою електронного приладу Densi-La-Meter
(PLIVA-Lachema а.s., Чехія) по шкалі McFarland згідно інструкції до приладу.
Синхронізація культур перед проведенням дослідів досягалася одноразовим впливом
низької температури [210].
Вивчення кінетики росту мікробів. Культури мікроорганізмів, вирощені на
твердому поживному середовищі (10%-ний сироватковий агар), змивали
фізіологічним розчином і доводили їх концентрацію до 1,0 одиниць по шкалі
McFarland, за допомогою приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema а.s., Чехія).
Після чого культури коринебактерій розливалися по стерильних пробірках,
прикладеним до приладу Densi-La-Meter. Аналогічно розливався і 1% глюкозний
бульйон. По 0,5 мл суспензії мікроорганізмів вносили до 4,5 мл 1% цукрового
бульйону.
Мікроорганізми вирощували при t=37 0С. Через 4, 8 і 18 годин у всіх штамів
визначали концентрацію мікробних клітин (конц. мікр. кл.) за допомогою приладу
Densi-La-Meter (довжина хвилі 540 нм) чи КФК-2 (довжина хвилі 540 нм, L=10
мм).
Швидкість розщеплення глюкози вивчали за часом зміни забарвлення субстрату з
індикатором [253-255].
Визначення кількості мікроорганізмів. Концентрацію мікроорганізмів визначали
шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць (КУО) у кількості посівного
матеріалу й розведення за формулою:
, (2.1)
де Х – число КУО,
10 – постійний коефіцієнт при посіві 0,1 мл суспензії,
N – кількість колоній,
М – розведення (в 10, 100, 1000 рази тощо),
m – кількість посівного матеріалу.
Визначення токсигенних властивостей. Токсигенність визначали за методом
дискодифузії у агаровому гелі, згідно ”Методических рекомендаций по применению
модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации,
биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных бактерий “
Ю.Г. Фельдман та ін. 1988 [211].
В основі методу визначення токсигенності коринебактерій (in vitro) покладено
взаємодію між токсином і антитоксином, яка відбувається в твердих поживних
середовищах в місцях оптимального кількісного співвідношення токсину,
продукованого коринебактеріями дифтерії, що дифундує в агар, і антитоксичних
антитіл, які містяться в антитоксині. В тих ділянках аг
- Київ+380960830922