РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлений в дисертації експериментальний матеріал одержано в результаті досліджень, проведених в 1999-2001 рр. в лабораторії мікробіометоду Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.
2.1. ОБ'ЄКТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктами досліджень слугували: природний штам сумчастого гриба Chaetomium cochliodes Palliser 3250, виділений як активний антагоніст фітопатогенних грибів, депонований у Всесоюзному науково-дослідному інституті сільськогосподарської мікробіології під номером 38, на основі якого створено препарат хетомік [180], виробничий штам Enterobacter aerogenes 30ф, який є діючою основою препарату ризоентерину, що використовується для поліпшення азотного живлення рослин ярого ячменю [181, 182], одержаний нами новий штам азотфіксуючих бактерій Azospirillum brasilense 11, виділений із ризосфери ярого ячменю, який вирощувався на лучно-чорноземному вилугуваному легкосуглинковому грунті; ярий ячмінь (Hordeum distichon L.) сорту Гонар.
2.2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Відбір грунтових зразків, виділення, облік і культивування грибів здійснювали за загальноприйнятими методиками [183]. При вивченні комплексу характерних видів мікроскопічних грибів лучно-чорноземного вилугуваного легкосуглинкового грунту в кореневій зоні ярого ячменю зразки грунту відбирали в польовому досліді із орного шару (0-20 см) міжрядь, ризосфери і ризоплани ярого ячменю в фази колосіння і молочно-воскової стиглості.
Культурально-морфологічні ознаки грибів вивчали на сусло-агарі, середовищі Чапека та картопляно-глюкозному агарі. Їх ідентифікацію проводили за відповідними для конкретної систематичної групи мікроміцетів визначниками [32, 59, 184-188].
Для виділення грибів-збудників кореневих гнилей уражене коріння і стебла ярого ячменю ретельно очищали від грунту і промивали в проточній воді. Після поверхневої дезинфекції в 1% розчині AgNO3 і етиловому спирті матеріал переносили в чашки Петрі з фільтрувальним папером (волога камера) і паралельно висівали на сусло-агар і картопляно-глюкозний агар з додаванням антибіотиків [189].
Наявність різних видів мікроміцетів в грунті і кореневій зоні ярого ячменю визначали за частотою зустрічальності і по щільності (численності) видів (доля штамів певного виду від загального числа виділених штамів) [16]. Характерними вважались види з частотою зустрічальності понад 40%.
Антагоністичну активність грибів визначали методом змішаних (зустрічних культур) [190] на сусло-агарі в чашках Петрі діаметром 90мм з шаром середовища завтовшки 6мм, при температурі інкубації - 26-27оС. Для описання культуральних реакцій взаємодії грибів використовували шкалу Джексона і Карла в модифікації С.А. Симоняна і Т.С. Маміконяна [191].
Антагоністичну активність азотфіксуючих бактерій Azospirillum brasilense 11 і Enterobacter aerogenes 30ф щодо фітопатогенних грибів вивчали за допомогою методу агарових блоків [183, 192].
Для оцінки різниці між мікобіотою грунту міжрядь, ризосфери та ризоплани рослин ярого ячменю використовували коефіцієнт подібності Серенсона і індекси різноманітності і вирівняності Шеннона [193].
Облік чисельності і виділення азотфіксуючих бактерій здійснювали за загальноприйнятими в грунтовій мікробіології методами. Аеробні, факультативно-анаеробні, мікроаерофільні і анаеробні діазотрофи визначали методами граничного розведення на рідких середовищах Федорова-Калінінської і Виноградського [194].
Облік чисельності азоспірил проводили на агаризованому середовищі Касераса [195] з конго червоним, де вони утворюють темно-червоні, дрібні, сухі, зморшкуваті колонії діаметром 0,5-1,5 мм. Визначали кількість азотфіксуючих бактерій, що розвивались на напіврідких середовищах Доберейнер з малатом та Ешбі. Аеробні, факультативно-анаеробні і мікроаерофільні азотфіксуючі бактерії визначали на рідкому глюкозо-автолізатному середовищі Федорова-Калінінської. Азотфіксуючі анаеробні бактерії роду Clostridium та їх асоціації з іншими бактеріями виявляли на рідкому середовищі Виноградського. Чисельність бактерій роду Pseudomonas, що продукують флуорисцуючі пігменти (зелений, оранжевий та ін.), визначали на твердому середовищі з гліцерином [196]. Облік азотобактера проводили по кількості оброслих грудочок на твердому середовищі Ешбі з манітом.
Ідентифікацію бактерій Azospirillum brasilense 11 проводили за визначником Берджі [197] і на підставі порівняння з типовими штамами A. brasilense Sp. 7 і A. lipoferum ВКМ, які були отримані з колекції Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології. Використовували також опис бактерій роду Azospirillum в оригінальних роботах [77, 195].
Активність процесу азотофіксування вивчали в грунтово-рослинних монолітах за допомогою ацетиленового методу [198-200] на газовому хроматографі "Chrom-4" з полум'яноіонізаційним детектором. Колонка довжиною 370см була заповнена хромосорбом з ?-?'-оксидіпропіонітрилом. Температура термостату 50оС, газ-носій - азот, витрата газів (в мл/хвилину): водню - 30, азоту - 100, повітря - 500.
Здатність азотфіксуючих бактерій продукувати біологічно активні сполуки визначали за методом Берестецького [201].
Здатність діазотрофів колонізувати ризосферний грунт і ризоплану ярого ячменю вивчали резистентним методом [202].
Вміст хлорофілу А і хлорофілу В в листях ярого ячменю визначали за допомогою спектрофотометричного методу [203].
Вміст білка в зерні визначали за методом К'єльдаля [204] на приладі Кельтек шведської фірми ЛКБ, використовуючи перерахунковий коефіцієнт 0,625.
2.3. УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ВЕГЕТАЦІЙНИХ ТА
ПОЛЬОВИХ ДОСЛІДІВ
Вегетаційні досліди проводили в вегетаційному будиночку на дерново-середньопідзолистому пилувато-супіщаному грунті, який характеризується наступними агрохімічними показниками: рН водним - 5,9, вмістом загального азоту 0,07%, рухомого фосфору - 16, обмінного калію - 11мг/100г грунту, вміст гумусу - 1,0%. Вологість грунту підтримували на рівні 60% від повної во
- Київ+380960830922