РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика обстежених
З метою реалізації поставлених завдань вивчено мікробіоценоз шкіри біотопів
нижніх кінцівок (тильна та підошовна поверхня стопи, міжпальцевий проміжок) у
60 хворих на цукровий діабет різного віку: 20 дорослих осіб склали контрольну
групу обстежених, у яких не виявлено будь-яких гнійно-некротичних уражень
нижніх кінцівок (I група); 20 хворих склали групу обстежених, у яких цукровий
діабет був ускладнений синдромом стопи діабетика І-ІІ cтупенів тяжкості (F.W.
Wagner, 1981) і яким у комплесному лікуванні ССД було застосовано А-бактерин та
вивчено зміни автомікрофлори шкіри стопи під впливом евбіотика (II група); та
20 хворих із ІІІ-ІV ССД ступенів тяжкості (III група).
Дослідження проводилися на базі хірургічного відділення міської лікарні №1 та
ендокринологічного відділення обласної лікарні м. Тернополя.
2.2. Штами мікроорганізмів, поживні середовища
Під час проведення мікробіологічних досліджень шкіри виділено 892 штами
аеробних мікроорганізмів, які належали до 10 родів. У всіх виділених культур
вивчено морфологічні, тинкторіальні, культуральні, біологічні та інші
властивості (продукція різних типів пігментів, каталази, оксидази,
плазмокоагулази, лецитинази, фосфатази, лізоциму, ацетоїну, гемолізинів,
окислення різних вуглеводів і спиртів, здатність відновлювати нітрати в
нітрити), чутливість до 8 антибіотиків.
З метою дослідження мікробіоценозу шкіри людини застосували наступні поживні
середовища: 1 % глюкозний МПА, кров’яний МПА (КМПА) з 5 % еритроцитів барана
для вивчення гемолітичних властивостей, жовтково-сольовий агар Чистовича (ЖСА)
або маніт-сольовий агар (МСА) для ізоляції стафілококів, середовища Ендо,
Левіна для якісного і кількісного визначення ентеробактерій, середовище Тарро –
для обліку стрептококів, фуразолідоно-твіновий агар (ФТА) – для диференціації
та кількісного обліку мікрококів та коринебактерій.
2.3. Методика дослідження мікрофлори шкіри
З метою вивчення шкірного мікробіоценозу стопи використовували метод
змивів-зіскобів Williamson і Kligman (1985) в модифікації Климнюка С.І. та
Ситника С. І. (1995)[ 64, 298, 304].
Через 24-96 годин інкубації при оптимальній температурі підраховували кількість
колоній за допомогою приладу ПСК, а результат виражали числом колонієутворюючих
одиниць (КУО) на 1 см2 площі шкіри за формулою:
, (2.1)
де Х – число КУО/см2,
20 – постійний коефіцієнт при посіві 0,1 мл проби,
M – кількість колоній, що виросли,
N – розведення (в 1, 10, 100 разів тощо).
Враховуючи, що число мікробів на одиницю площі може сягати мільйонів особин,
використовували десятковий логарифм цього показника –
lg КУО/см2.
Мікроорганізми ідентифікували згідно класифікації Bergey (1997), а також
викладеної в Mikrobiologische Diagnostik (1992) [120, 210].
2.4. Визначення антибіотикочутливості штамів виділених мікроорганізмів
Чутливість одержаних штамів до антибіотиків визначали на середовищі
Мюллера-Хінтона за допомогою стандартних паперових дисків. Облік результатів
проводили згідно “Методических указаний по определению чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков”
та „Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів”
[107].
Для контролю стандартності проведення досліджень у кожному досліді
використовували тест-культури E. coli (АТСС 25922), S. aureus (АТСС 25923) та
P. aeruginosa (АТСС 27853). Згідно МВ 9.9.5-143-2007 (Київ) досліджувані штами
відносили до однієї з трьох категорій чутливості: стійкі, помірно стійкі,
чутливі.
2.5. Визначення адгезивних властивостей мікроорганізмів
Досліджені адгезивні властивості бактерій, виділених у 3 групах хворих на
цукровий діабет. Першу (контрольну) групу склали ті особи, що не мали будь-яких
гнійно-некротичних уражень стопи; другу – хворі з ССД I - II ступенів тяжкості,
третю – особи, які мали ССД III-IV ступенів. Адгезивність мікроорганізмів
другої групи оцінювали двічі: до та після місцевого використання А-бактерину.
Досліджено 225 штамів мікроорганізмів, виділених з досліджуваних топодемів
стопи в першій групі, 342 культури бактерій, висіяних зі шкіри стопи діабетика
I-II ступенів тяжкості та 248 штамів – у третій групі.
З огляду на те, що принципова будова рецепторного шару, незважаючи навіть на
тканинну специфічність, у багатьох клітин макроорганізму є досить близькою
[21], адгезивні властивості представників шкірних мікробіоценозів стопи
діабетика вивчали на моделі клітин макроорганізму, використовуючи еритроцити
людини 0/1Rh(+) – групи крові експрес-методом за методикою Бріліса В. І.
(1986).
Виділені мікроорганізми вирощували на протязі 1- 2 діб в оптимальному для них
рідкому середовищі. На буферному розчині фосфату натрія, молярна концентрація
якого 0,1 моль/л, приготованому на ізотонічному розчині хлориду натрія (рН 7,2
- 7,3), готували суспензію формалізованих еритроцитів концентрацією 100 млн/мл.
Для постановки досліду на предметне скельце наносили одну краплю буферного
розчину, в яку вводили по одній краплі суспензій еритроцитів та
мікроорганізмів. Предметне скло розміщували у вологій камері на 30 хвилин при
37 °С, далі висушували при тій же температурі, фіксували жаром і фарбували за
загальноприйнятими методиками.
Адгезивні властивості мікроорганізмів оцінювали за допомогою середнього
показника адгезії (СПА). Під ним розуміли середню кількість мікроорганізмів,
які асоційовані з одним еритроцитом, при підрахунку не менше 25 еритроцитів.
При значенні СПА від 0 до 1,0 бактерії вважали неадгезивними, від 1,01
- Київ+380960830922