РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень.
У роботі були використані такі штами дріжджів Pichia guilliermondii: АТСС 9058 - дикий тип; штами генетичної лінії L1 ade2-19 MAT+, L2 hisX-17 MAT--, L3 metX-1 MAT+, L4 cytX-1 MAT--; регуляторні мутанти 1018/33 metX-1 rib80-22 MAT+, S131/6 metX-1 rib81-131 MAT+, SW6-18 hisX-17 rib83 MAT+, Rop--13 metX-1 rib83 MAT--, Rop--27 metX-1 rib83 MAT--; РА49 ade2 rib7 MAT+ - РФ-залежний мутант; D163 L26 Arg- rtr+ ( I ) MAT-- - мутант, у якого порушений транспорт РФ; Д26/5-3С.6 rib7 rtr+ rib81 MAT-- - надсинтетик ДМРЛ (сконструйований у даній роботі). Штам дріжджів Hansenula polymorpha ML8 Ade- був використаний для отримання міжродових гібридів з дріжджами P. guilliermondii шляхом злиття протопластів. Всі штами були селекціоновані і підтримуються у відділі регуляторних систем клітини. Бактерійний штам E. coli DH5? lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+), supE44, relA1, deoR, ?(lacZYA-argF)U169) використовувався для селекції та ампліфікації плазмід (з колекції відділу молекулярної генетики і біотехнології).
2.2. Умови культивування.
Дріжджі вирощували у модифікованому середовищі Беркгольдера [181], що готувалось на дистильованій або бідистильованій воді. В 1л середовища містилось 20 г сахарози, 3 г (NH4)2SO4 або 1 г сечовини, 0,5 г KH2PO4, 0,2 г MgSO4 • 7 H2O, 0,2 г CaCl2 • 6 H2O, 0,056 мг H3BO4, 0,039 мг CuSO4 • 7 H2O, 0,054 мг MnSO4 • 7 H2O, 0,12 мг (NH4)6Mo7O24 • 4 H2O, 0,308 мг ZnSO4 • 7 H2O, 1 мкг біотину. pH середовища - 5,0-5,5. Використовували середовища з високим (0,2 мг/л -середовище з оптимальним для росту вмістом заліза) і низьким (0,01 мг/л - залізодефіцитне середовище) вмістом заліза, яке додавали у вигляді солі Мора - (NH4)2SO4 FeSO4 • 6 H2O. Від заліза середовище очищали за допомогою 8-гідроксихіноліну [167]. Дріжджі вирощували при 30 оС на круговій качалці (200 об./хв.) у пробірках на 20 мл та колбах Ерленмейера на 100 мл і 500 мл, які містили 2 мл, 20 мл і 200 мл середовища, відповідно, на протязі 48 - 120 год.
Агаризовані середовища містили 2 % агару. При вирощуванні ауксотрофів у середовище вносили необхідні фактори росту: аденін, метіонін, гістидин, цитозин - по 40мг/л, лізин і РФ - по 200 мг/л. У всіх випадках середовища стерилізували автоклавуванням (0,5 - 1 атм, 25 - 30 хв).
У випадку гібридизації дріжджів використовували такі середовища [13]:
YEPSR: дріжджовий екстракт - 10 г, пептон - 20 г, сахароза - 20 г, РФ - 0,2 г, агар - 20 г, дистильована вода - до 1 л;
ацетатне: ацетат Na - 10 г, KCl - 5 г, агар - 20 г, дистильована вода - до 1 л.
Бактерії E. coli DH5? вирощували при 37 оС на середовищі LB: дріжджовий екстракт - 1 %, пептон - 1,5 %, NaCl - 1 %. Для селекції клітин, які містили плазміди, використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л.
Для трансформації штами дріжджів вирощували при 30 оС на багатому середовищі YPD: дріжджовий екстракт - 1 %, пептон - 1,5 %, сахароза - 2 %.
2.3. Визначення біомаси клітин.
Біомасу (в мг абсолютної маси на 1 мл суспензії) визначали турбідиметричним методом на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М (світлофільтр №6, кювета 3 мм), розраховуючи суху вагу згідно калібрувальної кривої.
2.4. Визначення концентрації флавінів.
Вміст флавінів у культуральній рідині і екстрактах клітин визначали флуоро-метрично на апараті ЕФ-3М, використовуючи для стандартного розчину РФ синте-тичний вітамін В2 [171]. Вміст флавінів у преміксах визначали по [172].
2.5. Отримання безклітинних екстрактів дріжджів.
Клітини відокремлювали від середовища центрифугуванням і тричі промивали бідистильованою водою та 0,02 М тріс-НСl буфером рН 8,2, який містив 2·10-3 М MgCl2 [217] Руйнування клітин дріжджів проводили в гомогенізаторі Л-17. Готували суспензію клітин з розрахунку 80-100 мг клітин сухої ваги в 1 мл 0,02 М тріс-НСl буферу рН 8,2 з 2 · 10-3 М MgCl2. На 12 мл суспензії брали 8 мл скляних кульок (d = 340 мк). Руйнування проводили при 1000 об./хв. на протязі 5 хв. з охолодженням (4 оС). Зразки центрифугували 45 хв. при 18 000 об./хв., отримані екстракти діалізували в 0,5 л цього ж буферу при 4 оС на протязі 12 - 15 год.
2.6. Визначення концентрації білка у безклітинних екстрактах.
Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали по Лоурі [218], використавши як стандарт альбумін сиворотки бика.
2.7. Визначення вмісту негемінового заліза в клітинах дріжджів.
Концентрацію негемінового заліза в клітинах визначали за методом [219], загальний вміст заліза у клітинах - за [220].
2.8. Визначення швидкості поглинання міченого заліза.
Для визначення швидкості поглинання заліза клітинами використовували циклотронне 55FeCl3 з питомою активністю 16 · 1011 Бк/г в 0,5 N HCl (Ленінградське відділення В/О "Изотоп"). Склад інкубаційної суміші та умови визначення описані у [221].
2.9. Визначення фериредуктазної активності клітин дріжджів.
Фериредуктазну активність клітин дріжджів визначали за допомогою модифікованого методу [222], використавши для зв'язування Fe(II) його хелатор ?,?'-дипіридил.
2.10. Визначення активності ГТФ-циклогідролази ІІ.
Визначення проводили за [165]. За одиницю активності ГТФ-циклогідролази ІІ (Од.) приймали кількість ферменту, яка забезпечувала синтез 1 мкмоля продукту за 1 хв. Питому активність виражали числом одиниць на 1 мг білку.
2.11. Отримання 6,7-диметил-8-рибітиллюмазину.
ДМРЛ отримували з культуральної рідини сконструйованого штама-надсинтетика цього метаболіта Д26/5-3С.6. Штам був отриманий внаслідок суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib7, rtr+, rib81. Для цього спочатку схрестили штам D163 L26 Arg- rtr+ ( I ) MAT- з мутантом РА49 ade2 rib7 MAT+ і з отриманого диплоїда виділили колекцію мейотичних сегрегантів генотипу rib7 rtr+. Один з них схрестили з мутантом S131/6 metX-1 rib81-131 MAT+. З отриманого диплоїд