РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Живильні середовища, реактиви для проведення досліджень
2.1.1. Виділення й культивування штамів ентерококів проводили з використанням наступних середовищ:
2.1.1.1. Основне середовище - цукрово-дріжджовий поживний агар (35 г сухого поживного агару, 20 мл дріжджового автолізату, 10 г глюкози, 1000 мл дистильованої води) - компоненти розплавляють при нагріванні, фільтрують і стерилізують при 112?С 15 хв, рН середовища 7,2 - 7,4.
2.1.1.2. Цукрово-дріжджовий агар із кристалічним фіолетовим (підтверджуюче середовище) - до основного середовища після стерилізації при 112?С 15 хв і перед розливанням у стерильні чашки Петрі додають кристалічний фіолетовий 1 : 800000 (1,25 мл 0,01 %-вого водяного розчину на 100 мл середовища).
2.1.1.3. Жовчно-лужний агар (ЖЛА) - компоненти основного середовища, розраховані на 1000 мл, розчиняють у 600 мл дистильованої води, вносять 400 мл свіжої бичачої жовчі, додають 5 г карбонату натрію, стерилізують автоклавуванням при 112?С 15 хв, перед розливанням у стерильні чашки Петрі вносять 50 мл консервованої крові людини, 12,5 мл 0,01 %-вого розчину кристалічного фіолетового і 20 мл 10 %-вого розчину гідроксиду калію.
2.1.1.4. Жовчно-лужний бульйон (ЖЛБ) - до 600 мл поживного бульйону додають 20 мл дріжджового автолізату, 10 г глюкози, 400 мл свіжої бичачої жовчі, 5 г карбонату натрію, стерилізують автоклавуванням при 112?С 15 хв, перед розливанням у стерильні пробірки вносять 50 мл консервованої крові людини, 12,5 мл 0,01 %-вого розчину кристалічного фіолетового і 20 мл 10 %-вого розчину гідроксиду калію.
2.1.1.5. Середовище "Діф-4" - у 100 мл 2 %-вого поживного агару після стерилізації вносять 1 г маніту (попередньо розчиненого в невеликій кількості середовища), 5 мл 10 %-вого карбонату натрію, 2 мл 1,6 %-вого лужного розчину тимолового синього.
Готування лужного розчину тимолового синього: 1,6 г реактиву розчиняють у 34,4 мл 0,4 %-вого розчину їдкого натрію, після розчинення додають 100 мл дистильованої води.
2.1.1.6. Молочно-пригнічуюче середовище (МІС) - до 90 мл розплавленого 2,5 %-вого поживного агару додають 2 мл дріжджового екстракту рідкого, при помішуванні додають 10 мл стерильного знежиреного молока, 1,25 мл 0,01 %-вого водяного розчину кристалічного фіолетового й після остигання суміші до 60?С - 1 мл 2 %-вого телуриту калію, усе перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі.
2.1.1.7. Середовище для визначення рухливості - напіврідкий живильний агар - до живильного бульйону додають 0,5 % агар-агару, нагрівають, фільтрують у гарячому стані через вату, освітлюють відстоюванням у термостаті при 37?С до застигання агару, зрізують прозору частину застиглого агару, розтоплюють, додають 1 % глюкози, 2 % дріжджового екстракту, розливають у пробірки по 5-8 мл, стерилізують в автоклаві при 120?С 20 хв.
2.1.1.8. Середовище з ескуліном - селективний агар за Пфайзером - гідролізат казеїну 17 г; пептон 3 г; дріжджовий екстракт 5 г; жовч 10 г; натрію хлорид 5 г; натрію цитрат 1 г; ескулін 1 г; заліза амонійний цитрат 0,5 г; натрію азид 0,25 г; агар-агар 15 г. Розмішують у 1000 мл дистильованої води, доводять рН до 7,1; підігрівають до кипіння для повного розчинення часток; розливають у пробірки; стерилізують автоклавуванням при 121°С 15 хв. Ескулін гідролізується ентерококами на ескулетин і глюкозу. Заліза амонійний цитрат, взаємодіючи з ескулетином, утворює коричнево-чорний преципітат.
2.1.1.9. Середовище з 6,5 %-вим вмістом натрію хлориду - до стерильного поживного бульйону додають 1 % глюкози, 2 % дріжджового екстракту і 6,5 % натрію хлориду; розливають у стерильні пробірки й стерилізують при 112°С 12 хв.
2.1.2. Внутрішньовидову ідентифікацію ентерококів проводили за біохімічною активністю на живильних середовищах.
2.1.2.1. Живильні з середовища вуглеводами (ферментація вуглеводу з утворенням кислоти без газу):
Середовище із глюкозою - пептону 1 г; хлористого натрію 1 г; дріжджового екстракту 2 мл; глюкози 0,5 г; води дистильованої 100 мл. Компоненти розчиняють, стерилізують при 112?С 12 хв в автоклаві.
Середовище із сахарозою - пептону 1 г; хлористого натрію 1 г; дріжджового екстракту 2 мл; сахарози 0,5 г; води дистильованої 100 мл. Компоненти розчиняють, стерилізують при 112?С 12 хв в автоклаві.
Середовище із сорбозою - пептону 1 г; хлористого натрію 1 г; дріжджового екстракту 2 мл; сорбози 0,5 г; води дистильованої 100 мл. Компоненти розчиняють, стерилізують при 112?С 12 хв в автоклаві.
Середовище з арабінозою - пептону 1 г; хлористого натрію 1 г; дріжджового екстракту 2 мл; арабінози 0,5 г; води дистильованої 100 мл. Компоненти розчиняють, стерилізують при 112?С 12 хв в автоклаві.
2.1.2.2. Середовище з 2,3,5-трифенілтетразолій-хлоридом (ТТХ) - до 100 мл поживного агару с рН 6,0 додають розчинені у невеликій кількості дистильованої води й прокип'ячені на водяній бані 1 г глюкози і 0,01 г ТТХ, ретельно змішують і розливають у чашки Петрі.
2.1.2.3. Середовище з аргініном - пептону 5,0 г; хлористого натрію 5,0 г; дріжджового екстракту 25,0; глюкози 1,0г; натрію карбонату 0,1 г; бромтимолового синього (0,1 % розчин у 20 % спирті) 45,0; амінокислоти у L-формі 10,0; води дистильованої 1 л. Компоненти розчиняють при нагріванні, рН 6,4, додають індикатор і поділяють середовище на 2 частини. В одну частину амінокислоту не додають - це контроль, у другу додають - аргінін. Середовище розливають по 1- 2 мл у хімічно чисту стерильні пробірки й стерилізують при 0,1 - 0,2 атм 20 хв у автоклаві.
2.1.3. Визначення факторів патогенності ентерококів проводили на наступних середовищах:
2.1.3.1. Середовище для визначення гемолітичної активності (5 %-вий кров'яний агар) - 95 мл поживного агару розплавляють, охолоджують до 45?С, ретельно перемішують з 5 мл дефібринованої чи свіжої крові (людини чи кролика), розливають у стерильні, поперед
- Київ+380960830922