РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Об'єкти дослідження
У роботi використовували наступні штами мікроорганізмів:
Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX) - безкаталазний мутант метилотрофних дріжджів зі знятою катаболітною репресією (конститутивний синтез АО при рості на глюкозному середовищі).
Saccharomyces cerevisiae - штами термотолерантних дріжджів, виділені із Еволюційних Каньйонів, передані професором Eviator Nevo (Institute of Evolution University of Haifa, Ізраїль).
Aspergillus japonicus NRRL 359, NRRL 360, NRRL 1788, передані для дослідження професором C.P. Kurtzman (Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit, Peoria, Illinois, США).
Botrytis allii 64, 100(5), 100(7), передані для дослідження професором О.І. Нетруcовим (біологічний факультет МДУ ім. М.В. Ломоносова, Москва, Російська Федерація).
2.2. Умови культивування
Клiтини H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) культивували до середини логарифмiчної фази росту в колбах при 30 oС на шейкері при постiйнiй аерацiї (240 об./хв) у мінеральному середовищi з рН близько 5,2-5,6 наступного складу, г/л: КH2PO4 - 1; (NH4)2SO4 - 3,5; MgSO4 x 7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,1. Середовище містило дрiжджовий екстракт "Дiфко" (0,2 %) як джерело мікроелементів та вітамінів. Як джерело вуглецю використовували 1 % (w/v) глюкозу.
Біомасу цвільових грибів Aspergillus japonicus NRRL 359, NRRL 360, NRRL 1788 та Botrytis allii 64, 100(5), 100(7) вирощували у колбах об'ємом 250 мл при 20 - 25oС на водяному шейкері "Еlpan", модель 357 (Польща) при постійній аерації (150 об./хв., амплітуда 10) на середовищі з рН 3,5 наступного складу, г/л: КNO3 - 3,5 г, KH2PO4 - 3 г, NaCl - 0,5 г, MgSO4·7H2O - 0,5 г, FeSO4·7H2O - 0,01 г, CuSO4·5H2O - 0,001 г. Джерелом вуглецю служив гліцерол (60 г/л) та меляса (2 г/л).
В окремих випадках використовували інші спеціальні середовища, особливості складу яких відмічено при обговоренні відповідних експериментів.
2.3. Визначення концентрації клітин
Біомасу клітин H. polymorpha (в мг абсолютної маси на 1 мл суспензії) визначали за мутністю розведених суспензій шляхом їх фотометрування на приладі ФЕК КФК-3 при 540 нм в кюветі 3 мм.
Розрахунок проводили за формулою:
Е540?n
С = ???? ,
1,33
де Е540 - оптична густина при 540 нм;
n - розведення вихідної суспензії;
1,33 - коефіцієнт перерахунку, визначений при калібруванні гравіметричним методом.
2.4. Пермеабiлiзацiя клiтин
Відмиту від середовища біомасу H. рolymorpha ресуспензували у 50 мМ K, Na-фосфатному буфері, рН 7,5, що містить 2 мМ ЕДТА, до концентрації клітин 20 - 50 мг/мл (у перерахунку на суху масу), а біомасу цвільових грибів - у 50 мМ боратному буфері, рН 9,18. До суспензії клітин додавали рівний об'єм водного розчину дигiтонiну або цетилтриметиламоній броміду (2 мг/мл). Сумiш iнкубували на водянiй лазні при 30 oС, збовтуючи її кожнi 2 - 3 хв упродовж 15 хв. Пiсля пермеабiлiзацiї біомасу тричi вiдмивали відповідним буфером. Пермеабiлiзовані клiтини H. рolymorpha і цвільових грибів використовували для визначення активності оксидаз. Концентрацiю "тiней" H. polymorpha
(пермеабілізованих клітин) визначали як у випадку iнтактних клiтин (див. 2.3).
2.5. Отримання безклiтинного екстракту
Вирощені клiтини дріжджів промивали двiчi водою та один раз 10 мМ К,Nа-фосфатним буфером, рН 7,0. Далі до осаду клітин додавали 50 мМ К,Nа-фосфатний буфер, рН 7,0 з 2 мМ ЕДТА до кiнцевої концентрацiї клiтин 90 - 100 мг/мл та інгібітор протеїназ фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) у концентрації 0,4 мМ. Одержану суспензiю розливали у стаканчики для гомогенiзацiї, вносили склянi кульки (дiаметр 0,45 - 0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на планетарному гомогенiзаторi упродовж 5 хв при 1000 об./хв при +4 оС.
Для отримання безклітинного екстракту з цвільових грибів пермеабілізовану та відмиту біомасу 50 мМ боратним буфером, рН 9,18, що містить 2 мМ ЕДТА, ресуспензували у цьому ж буфері, охолоджували та руйнували у ступці шляхом розтирання у присутності 0,1 % тритону Х-100.
Для отримання безклітинного екстракту гомогенiзати дріжджів чи грибів центрифугували упродовж 20 хв при 15000 об./хв при +5 оС на центрифузі ЦР-21. Для проведення наступних процедур відбирали супернатант.
2.6. Визначення концентрації білка
Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі, який ґрунтується на утворенні забарвлених продуктів реакції ароматичних амінокислот з реактивом Фоліна у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв'язки [120]. Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика.
2.7. Визначення активностi ферментів
2.7.1. Визначення активностi оксидаз
Активність оксидаз визначали за кількістю продукованого пероксиду водню
за 1 хв у перерахунку на 1 мг білка або клітин. Пероксид водню аналізували фотометрично за утворенням кольорового продукту пероксидазного окислення о-діанізидина [24, 174].
2.7.2. Визначення активностi алкогольдегідрогенази
Активність алкогольдегідрогенази визначали за кількістю утвореного NADH(H)+ за приростом оптичної густини при 340 нм [168].
2.7.3. Визначення активностi пероксидази
Активність пероксидази визначали за кількістю утворенного кольорового продукту пероксидазного окислення о-діанізидину при 525 нм.
2.7.4. Одиниці вимірювання активності ферментів та загальна формула розрахунків
Питому активність ферментів виражали в мкмоль субстрату (продукту), витраченого (утвореного) за 1 хв в перерахунку на 1 мг білка або сухої маси клітин за стандартних умов реакції (мкмоль?хв-1?мг-1). Якщо не зазначено інші спеціальні умови, інкубацію реакційної суміші проводили при 30 oС на водяній лазні або в термостатованій кюветі спектрофотометра.
Розрахунок питомої активності ферментів проводили за наступною формулою:
A?V?n
П.А. = (мкмоль?хв-1?мг-1), де
?мМ ?VE?t?c
А - оптична густина кінцевого фотометрованого розчину;
V - загальний об'єм кінц
- Київ+380960830922