РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С целью изучения иммунологической структуры населения на наличие специфических
антител к Legionella pneumophila Philadelphia I исследовано 2686 донорских
сывороток крови у различных контингентов: гражданские лица, военнослужащие,
члены экипажей судов (г.Одесса).
С диагностической целью обследовано 1383 больных пневмониями и острыми
респираторными заболеваниями (гг.Одесса, Николаев, Сумская область, Донецк),
исследовано 62 пробы секционного материала (биоптаты легких).
Для изучения циркуляции легионелл в объектах окружающей среды исследовано 1446
проб воды и смывов, в том числе 163 - из естественных экосистем (вода рр.
Дунай, Днестр), 942 - с судов Черноморского флота, 86 - с городских
коммунальных объектов и 255 - с различных промышленных объектов (г.Одесса,
Сумская область).
Получена микробиологическая характеристика 32 штаммов легионелл, изолированных
из естественных и искусственных экосистем на территории Украины.
Изучение сорбции легионелл на полимерных материалах проведено на 6 образцах с
различным рельефом поверхности.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Для выделения и культивирования легионелл использовали
угольно-дрожжевой агар, приготовленный из соответствующих компонентов
непосредственно в лаборатории, и коммерческие готовые среды: питательная среда
для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная (СЭЛ),
производства Ростовского-на-Дону НИПЧИ; легионелбакагар, производства ЗАО «ННПЦ
ГИП», Оболенск.
Угольно- дрожжевую среду готовили по следующей прописи (г/л):
дрожжевой экстракт – 10,0
активированный уголь-2,0
L-цистеин – 0,4
пирофосфат железа растворимый-0,25
K2HPO4- 0,85
KH2PO4-1,0
агар- 17,0
дистиллированной воды – 980мл
Все компоненты кроме L-цистеина и пирофосфата железа растворимого вносили в 980
мл дистиллированной воды, доводили до кипения и автоклавировали при температуре
1210 С 15 минут. В охлажденную до 50о С среду (на водяной бане) добавляли
профильтрованные через мембранные фильтры, с диаметром пор 0,45мкм,
свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4г в 10 мл дистиллированной воды) и
пирофосфата железа растворимого (0,25г в 10 мл дистиллированной воды). Доводили
рН среды до 6,9 (при 50о С) добавлением 1N растворов КОН или НСl. Затем, слегка
взбалтывая флакон для равномерного распределения активированного угля, среду
быстро разливали по чашкам толстым слоем (30-35мл). Цвет готовой среды
черно-серый. Для исследования сильно контаминированного материала к среде
одновременно с цистеином и пирофосфатом железа добавляли антибиотики
(полимиксин В - 40 ЕД/мл + амфотерицин Б 80мкг/мл + ванкомицин 0,5мкг/мл).
Среду СЭЛ готовили в соответствии с прилагаемой инструкцией. Среда выпускается
комплектом, состоящим из агаризованной основы (по 400 мл в стеклянных
флаконах), добавок (стимуляторов роста и смеси антибиотиков) и реагентов
(кислотного буфера и активированного угля). Агаризованную основу расплавляли на
водяной бане, остужали до 45-500 С и добавляли стимуляторы роста, а для
исследования контаминированного материала дополнительно - антибиотики. Цвет
готовой среды черно-серый.
Легионелбакагар готовили следующим образом: 34г основы размешивали в 990 мл
дистиллированной воды, стерилизовали при температуре 1120 С в течение 30 минут
и охлаждали до 45-50 0 С. L-цистеина гидрохлорид в количестве 0,4г размешивали
в 10 мл дистиллированной воды и стерилизовали при температуре 1120 С - 30
минут. В охлажденный раствор основы асептически вносили раствор L-цистеина
гидрохлорида, тщательно перемешивали и разливали по 30-35мл в стерильные чашки
Петри. Цвет готовой среды красновато-коричневый.
В качестве контрольных сред для "теста роста" использовали мясо-пептонный агар
рН 7,2 и кровяной агар.
ДИАГНОСТИКУМЫ. Для серологических реакций использовали диагностикумы,
производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, г.Москва: люминесцирующую сыворотку против
глобулинов человека, сухую кроличью; антитела диагностические против
иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой, сухие; тест-систему
иммуноферментную для определения легионеллезного антигена; иммуноглобулины
легионеллезные, диагностические, люминесцирующие; антиген корпускулярный
Legionella pneumophila 1,2,3-го серотипа, опытно-экспериментальная серия.
Диагностикум легионеллезный серогруппы I антигенный сухой для реакции объемной
аггломерации и опытно-экспериментальная серия сывороток агглютинирующих
легионеллезных к виду Legionella pneumophila 1-7 сероваров производства
Ростовского- на-Дону НИПЧИ. В качестве антигена при постановке реакции
непрямой иммунофлюоресценции использовали также взвеси двух- суточных культур
Legionella pneumophila Philadelphia 1 в 0,85% растворе NaCl, изолированных при
локальных вспышках легионеллеза, убитых кипячением, в концентрации 5х108 КОЕ/мл
по оптическому стандарту.
БИОПРОБНЫЕ ЖИВОТНЫЕ. Использовано 28 морских свинок весом 250-300г.
ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА. Бактерицидная активность дезинфицирующих средств в
отношении легионелл изучена для препаратов, широко использующихся в практике
лечебно-профилактических учреждений: сокрена, корзолекс, лизоформин, хлорамин.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Использованы методы, направленные: 1) на
определение уровня специфических антител в сыворотках крови – реакция непрямой
иммунофлюоресценции (РНИФ), реакция объемной аггломерации (РАО),
иммуноферментный анализ (ИФА);
2) на обнаружение легионелл и их антигенов в клиническом и секционном
материале, объектах окружающей среды - реакция прямой иммунофлюоресценции
(РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА).
Подготовка материала к исследованию. Исследуемые сыво
- Київ+380960830922