ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования: объектами исследования были штаммы Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen 1919) Bergey et al. 1923 (ATCC 8014 и VKPM B-5002), L. delbrueckii subsp. bulgaricus (VKPM B-5004), Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii (Leichmann 1896) Weiss et al. 1984 (ATCC 9649), штаммы Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Orla-Jensen 1919) Farrow et Collins 1984 (VKPM B-3808 и VKPM B-3813) и другие, полученные из различных международных коллекций и хранящиеся в Украинской коллекции микроорганизмов[86] (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Штаммы молочнокислых бактерий, использованные в работе
ВидКод в коллекции№ штамма в УКМ и других коллекцияхВыделен или полученLactobacillus acidophilus306Д-кишечник долгожителяL. acidophilus4356-L. acidophilusB-1660TВКПМL. agilis161 м/фB-2603помет цыплёнкаL. amylophilus30/4/ 2Д-СилосL. amylophilusB-2234TВКПМL. brevis474--L. buchneri1819B-2670Т,
ATCC 4005, NCDO 110, NCIB 8007, CCM 1819, DSM 20057томатная пульпаL. casei175Д-кишечник долгожителяL. casei17п-кишечник цыплёнка
Продолжение табл. 2.1
L. casei subsp. tolerans117рB-2604кишечник цыплёнка L. casei subsp. rhamnosus1825--L. celobiosus927-СилосL. confusus39Т-кишечник телёнкаL. delbrueckiiД27/2-помет индюкаL. delbrueckii subsp. bulgaricus B-2700B-2700Кефир "Киевская К-1" L. delbrueckii subsp. bulgaricusB-1923TВКПМL. delbrueckii subsp. bulgaricusLB51-L. delbrueckii subsp. delbrueckii 213B-2671ТПивное суслоL. delbrueckii subsp. delbrueckii-B-1596TВКПМL. delbrueckii subsp. lactis270--L. fermentum50п-кишечник цыплёнкаL. fermentum28п-кишечник цыплёнкаL. fructivorans33т-рубец телёнкаL. helveticus364Д-кишечник долгожителяL. helveticus364Д-кишечник долгожителяL. plantarumС82B-2677ТПолучен из ATCCL. plantarum 337ДB-2627Микрофлора пищеварительного тракта долгожителей АбхазииL. plantarum-B-2209TВКПМL. plantarum64н-насекомые, пчелаL. plantarum67т-рыбы, кишечник карпаL. reuteri25пB-2697,
VKPM B-5005кишечник цыплёнкаL. ruminis478-зоб цыплёнка
Продолжение табл. 2.1
L. viridescens4/1/(55)-КефирStreptococcus salivarius subsp. thermophilusВ-2540B-2540Самосквашенные молочные продуктыS. salivarius subsp. thermophilusВ-2539B-2539Самосквашенные молочные продукты
Восстановление лиофилизированых культур и временное хранение. После длительного хранения (несколько лет) штаммы МКБ оживляли в МРС-бульоне (5-6мл) и культивировали при температуре 370С. Пересевание проводили до стабилизации их роста и далее для поддержания их активности. Суточные культуры выращивали при тех же условиях. Время инкубации для каждой культуры зависило от скорости роста и варьировало от 1-2 суток. Для временного хранения (1-1,5 месяца) использовали МРС-бульон с 2% мела.
Окрашивание по Граму и псевдокаталазная активность. Окрашивание клеток проводили по Граму с модификацией Синева. Для определения псевдокаталазной активности использовали среду, предложенную Фелтоном [22], с пониженной концентрацией глюкозы, в 0,5л которой содержалось: пептон - 1%, глюкоза - 0,05%, KH2PO4 - 0,2%, NaCl - 0,5%, дрож. экстракт - 0,5%, агар - 1,5% и дистилированая вода, pH = 6,8- 7,0.
Размер клеток и колоний. Морфологию клеток изучали у суточных или двухсуточных культур, выращенных в МРС-бульоне. Размер клеток рассчитывали по шкале, цена деления которой составляла 1 мкм. Чтобы увеличить точность определения, клетки фотографировали вместе со шкалой деления, после чего размер клеток определяли статистическими методами. Определяли максимальный, минимальный и размер наиболее часто встречающихся клеток. При расчете последней величины во внимание брали клетки приблизительно сходных между собой по размерам, после чего вычисляли среднеарифметическую величину (Ск). Данная величина характеризовала типичный размер клеток, встречающихся в культуре после 24 ч или 48 ч. Кроме размера учитывали форму клеток, тип концов и их расположение.
Характеристику колоний проводили на агаризованой среде МРС (1,5 % агара) без твина-80, по истечении 3-х суток. Учитывали форму, поверхность, профиль, цвет, прозрачность и форму края. Чашку с колониями фотографировали цифровой камерой с максимальным увеличением. Размер колоний определяли по снимку программными средствами в трех повторностях.
Подвижность. Для определения подвижности нами была использована модифицированная среда Геммеля и Ходгкиса [22]. На 500 мл среды, содержащей мясной экстракт - 2,5г, пептон - 2,5г, дрож. автолизат - 5 об. %, твин-80 - 0,25мл, MnSO4x4H2O - 50мг, лимоннокислый калий - 500мг, 1,6% спиртовый раствор бромкрезол пурпурного - 1,4мл, при pH = 6.5, вместо 0,15% агара добавляли - 0.30%. Более высокий процент агарозы необходим для более четкого разделения подвижных и неподвижных культур. Подготовленную среду разливали по 10мл в пробирки и охлаждали. После этого исследуемую активную культуру вносили в среду петлей вертикально. Подвижность определяли через 1-3 суток, в зависимости от скорости роста культуры. Неподвижные культуры росли плотно по ходу укола. У подвижных - наблюдали рассеяный рост в среде.
Выявление дыхательных систем, содержащих цитохром. Использовали метод, предложенный Дейблом и Эвансом [22]. В качестве индикатора использовали раствор, содержащий 0,5г бинзидина солянокислого, 10мл ледяной уксусной кислоты, 15мл дистилированой воды и 25мл 96% этилового спирта. На поверхность колоний 72-х часового возраста наносили раствор бензидина солянокислого, затем - 5%-ую H2O2. По наличию или отсутствию голубоватой окраски судили о наличии железо-порфириновых соединений.
Образование газа из глюкозы. Использовали среду Джибсона и Абд-эль-Малека [22]: глюкоза - 5,0г, капустный сок - 10мл (рН=6,5), дрожжевой автолизат-0,25мл; мясо-пептонный желатин (10-12%)- до 100мл В расплавленную среду вносили активную культуру, затем осторожно заливали голодным агаро
- Київ+380960830922