Розділ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об?єктом дослідження була нова мікроелементно-вітамінна композиція /КМВ/, розроблена в Інституті фармакології та токсикології. Композиція містить дві складові: суму комплексів мікроелементів і суму вітамінів, а саме - комплекси шести мікроелементів (Fe, Zn, Mn, Cu, Co, Cr) з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL) і вітаміни групи В (тіамін -В1, рибофлавін - В2, нікотинамід -В3, кальцію пантотенат - В5, піридоксин - В6). Для здійснення її синтезу в роботі використано хлориди вибраних металів в ступенях окислення Fe(III), Zn(II), Mn(II), Cu(II), Co(II), Cr(III) за кваліфікації, не нижчої за "ч.д.а.", та фармакопейну мефенамінову (HL) кислоту, а також очищену воду. Як допоміжну речовину, що сприяє гомогенізації активних компонентів в структурі композиції, використано лише фармакопейний крохмаль картопельний. Другим об?єктом дослідження став препарат порівняння - відомий мікроелементно-вітамінний препарат "Юнікап" (Pharmacia ? Upjohn) (США).
Фізико-хімічну ідентифікацію КМВ проводили методами рідинної хроматографії (вітаміни), адсорбційної (мікроелементи) та електронної спектроскопії (ліганд) [111].
Експерименти, в залежності від поставленних задач, проводилися на статевозрілих мишах, щурах і собаках обох статей масою тіла відповідно 18-28 г, 150-250 г, 10000-15000 г, а також на геріатричних щурах масою тіла 350-500 г. Тварини знаходилися на звичайному харчовому раціоні віварію без обмеження вживання води.
У відповідності з метою роботи при вивченні фармакологічних властивостей КМВ враховували вимоги до вивчення нешкідливості та специфічної дії новостворених засобів, що передбачаються до використання в Україні [136, 140, 166, 191, 213] .
Шляхи введення і дози препаратів визначались метою роботи і вказані у відповідних розділах.
Для виконання досліджень використовували матеріали, які мали відповідні позначки ДСТУ чи ОСТ, зазначені терміни випуску та можливого зберігання.
Для проведення біохімічних досліджень використано наступну
апаратуру та обладнання: іонометр універсальний, спектрофотометр, фотоелектрокалориметр, центрифуга ОПН-3, ваги торсіонні, ваги аналітичні ВЛР-200 г та інше лабораторне обладнання. Апаратура підлягала періодичному метрологічному контролю та мала позначки про його проходження.
В даному розділі наводяться основні методи досліджень, що використані у дисертаційній роботі. Доцільність їх викладення обумовлена широтою застосування в експериментальній практиці. З метою запобігання повторів та логічного викладу деякі з них більш детально наведені у відповідних розділах роботи. При дослідженні біохімічного статусу організму та визначенні стану окремих органів застосовані наступні методи дослідження: моноаміни визначали методом спектрофлюометрії [226], глікоген - за методом Монтгомері [85], показники обміну азоту (азот сечовини та залишковий азот) - спектрофотометрично за допомогою біотестів "Лахема" [190, 196]. Показники периферійної крові визначали стандартними методами, морфологічний склад підраховували в пофарбованих за Гімза-Романовським мазках крові, використовуючи для цього камеру Горяєва (еритроцити і лейкоцити), для визначення вмісту гемоглобіну використаний гемометр Салі, рівень ШОЕ визначався в апараті Панченкова.
Експериментальне дослідження нешкідливості лікарської речовини
складалося з вивчення таких характеристик: гострої, підгострої та хронічної токсичності. Вивчення залежності клінічних проявів від доз (концентрацій) композиції оцінювали за зовнішнім станом здоров?я дослідних тварин, поведінковими реакціями на зовнішні подразнення (дотик, біль, фізичне навантаження тощо), апетитом, відношенням до води, реакцією на "конфліктні" ситуації [124].
Загальнофармакологічні, специфічні властивості мікроелементно-вітамінної композиції визначали з урахуванням критеріальних вимог до розробки лікарських засобів, а також стандартними правилами дослідження нових засобів в Україні [110].
При проведенні експериментальних досліджень враховували функціональні показники: стану ЦНС, серцево-судинної системи, дихальної та видільної систем [4, 26].
Проводили морфологічні (макро-, мікро-) дослідження тканин, оцінювали зовнішній стан та гістологічну будову органів і тканин (головний мозок, серце, печінку, нирки, стравохід, селезінку, легені) за загальновизнаними методами (фіксація матеріалу в 10% нейтральному формаліні, парафінові та заморожені зрізи, фарбування гематоксиліном-еозином, суданом чорним - на жир, за Перлсом - на залізо, а також - за Слінченком [12, 71, 105, 106, 147, 183, 235].
Детоксикуючу активність печінки вивчали на підставі проведення гексеналової проби [54].
Функцію зовнішнього дихання досліджували, визначаючи частоту дихання (ЧД) [59].
Досліджували вплив композиції на діяльність серця та стан гемодинаміки [114, 133, 139, 172, 189, 197].
Вивчення впливу композиції на фізичну працездатність проводили на щурах. При цьому оцінювали граничну тривалість виконання навантаження на тлі попереднього введення КМВ. При вивченні впливу КМВ на фізичну працездатність в умовах динамічних навантажень використовували плавальну пробу. Грунтовний огляд по даній методиці викладений в літературних посиланнях [23, 188]. Необхідно відмітити, що при виконанні даної методики необхідно суворо витримувати деякі методичні деталі, які дозволять відтворити одержані результати. По-перше, вода повинна бути прокип?яченою для видалення пухирців повітря, які осідають на шерсті піддослідних тварин і утворюючих ефект "рятувального кола". По-друге, з погляду того, що тривалість плавання в нормі у щурів може перевищувати більше 30 годин, необхідно збільшувати навантаження для тварин додатковим вантажем. Для щурів цей вантаж не повинен перевищувати 15% від маси тіла. Навантаження плаванням у щурів відбувалось в посуді великого об?єму з величиною шару 60 см. Щурі плавали ізольовано в окремих відділах. Контроль стану окислювально-відновних реакцій здійснювали з допомогою аналізу крові.
При оцінці впли