ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Общая характеристика экспериментальной модели
В работе использовались крысы самцы линии Вистар, полученные из вивария института геронтологии АМН Украины (Киев). Перед проведением экспериментов животные в течение месяца содержались в клетках по 10 штук и обеспечивались стандартным рационом питания.
В исследованиях использовалось 172 крысы. Животные делились на две возрастные группы: взрослые - 10-12 месяцев (масса 150-280 г) и старые - 22-25 месяцев (масса 250-390 г). Каждая группа, в свою очередь делилась на четыре подгруппы: 1 - интактные (n = 42), 2 - крысы, подвергнутые иммобилизационному стрессу (n = 84), 3 - животные, которым за 30 минут до иммобилизации внутрибрюшинно вводился раствор румосола - морфолиний 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоацетат - (n = 23) и 4 - крысы, которым за 30 минут до иммобилизации внутрибрюшинно вводился раствор 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоацетата калия (n=23).
С целью моделирования иммобилизационного стресса крысы подвергались обездвиживанию путем привязывания за конечности спиной к неподвижной опоре (доске). Время иммобилизации - 30 минут. Сразу после этого животные подвергались эфтаназии путем декапитации.
Эффективность воспроизведения стресса контролировалась с помощью комплекса биохимических, физиологических и патоморфологических исследований. В качестве биохимических тестов, подтверждающих развитие стресса, использовались определение концентрации адреналина и норадреналина (табл. 2.1), 11-оксикортикостероидов (рис. 2.1), активности лактатдегидрогеназы и содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, ТБК+-активных веществ и шиффовых оснований ) в крови [23, 100].
Таблица 2.1
Концентрация адреналина и норадреналина в сыворотке крови крыс, подвергнутых иммобилизации ( M + m; n)
Показатель
Взрослые
Старые интактныестрессинтактныестресс Адреналин1,7 + 0,2
64,0 + 0,4*
61,0 + 0,1
61,8 + 0,1*
6 Норадреналин18,0 + 2,2
624,9+ 1,8*
610,0 + 0,7
624,3 + 1,4*
6
Примечания: 1. Концентрация выражена в нмоль / л.
2. * - достоверные различия по сравнению с интактными животными (р < 0,05).
На основании результатов биохимических [23, 100], патоморфологических и электрофизиологических исследований [101] можно сделать заключение о том, что обездвиживание животных сопровождалось формированием у них состояния
%
*
Рис. 2.1. Изменение концентрации 11- оксикортикостероидов в крови крыс при иммобилизации ( уровень 11-ОКС в крови интактных животных принят за 100%)
иммобилизационного стресса. Его проявлением служили сдвиги, отражающие возбуждение симпатоадреналовой системы, усиление секреции глюкокортикоидных гормонов, стимуляцию перекисного окисления липидов в организме и характерные изменения со стороны структуры и функции ряда внутренних органов (изменения в состоянии микроциркуляции сердечной мышцы, характерные сдвиги на ЭКГ и др.) [48, 65].
С целью проведения фармакологической коррекции изменений со стороны обмена веществ при стрессе, в специальных экспериментах животным перед иммобилизацией вводились препараты, обладающие антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами. В качестве подобных средств использовались морфолиний 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоацетат (румосол) и 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоацетат калия (рис.2.2 и 2.3).
Рис.2.2. Структура морфолиния 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоацетата C9H8N4O2S C4H9NO (М.м. 327,38).
Рис.2.3. Структура калиевой соли 3-(4-пиридил)-1,2,4-триазолин-5-тиоуксусной кислоты C9H8N4O2S К (М.м. 275,35).
Оба соединения были синтезированы на кафедрах фармхимии и неорганической химии Запорожского государственного медицинского университета**.
___________________________________________________________________
** Выражаю искреннюю благодарность профессору кафедры организации экономики фармации Кнышу Е.Г. за любезно предоставленные синтетические препараты для исследований
Специальные исследования позволили выявить у них выраженное антиоксидантное [27], антистрессорное [101] и гепатопротекторное [61] действие. Перед введением препараты разводились изотоническим раствором хлорида натрия и вводились внутрибрюшинно однократно в дозе 50 мг на 1 кг массы за 30 минут до иммобилизации.
Эксперименты проводились в первой половине суток.
2.2. Методика фракционирования гомогенатов печени.
Животные декапитировались. Вскрывалась брюшная полость. Извлекалась печень и помещалась в охлажденный до 00 С 1,15% раствор КСl. Экстирпированный орган отмывался от крови, отжимался на марлевой салфетке, взвешивался и измельчался ножницами. Измельченная масса использовалась для приготовления гомогената. С этой целью навеска ткани гомогенизировалась в течение 1 минуты (20-30 движениями пестика ) в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком при отношении массы ткани к объему 1,15% раствора КСl равном 1:3. Приготовленные таким образом гомогенаты использовались для получения микросомальной фракции. В основу фракционирования был положен метод И.И.Карузиной и А.И.Арчакова [32].
Полученные гомогенаты фильтровались через два слоя марли в пробирки к центрифуге ЦЛ-310b с рабочим объемом 10 мл. Фильтраты центрифугировались при 10000 g в течение 20 мин. Все процедуры проводились в условиях стационарной холодильной камеры КХС-1 при +040 С.
Надосадочная жидкость, не содержащая ядер и митохондрий, подвергалась центрифугированию при 105000 g в течение 60 мин при +40С на ультрацентрифуге МОМ-3180 (Венгрия). Полученная после центрифугирования надосадочная жидкость удалялась, а осадок, представляющий собой осажденные микросомы, суспендировался в среде выделения из расчета 1 мл 1,15% раствора КСl на 1 г ткани печени (рис.2.4