Глава 2.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и условия эксперимента
В экспериментах были использованы крысы линии Вистар, самцы и самки 3-х
месячного возраста массой 180-250 г, которые содержались в стандартных условиях
вивария Харьковского национального университета. Все растворы для инъекций
готовили на физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно. При работе
соблюдали этические принципы экспериментальных исследований [171]. Манипуляции
и декапитацию животных осуществляли под тиопенталовым наркозом. В биохимических
исследованиях использовали сыворотку крови и гомогенаты органов (печени и
почек), причем печень перед гомогенизацией отмывали путем перфузии охлажденным
физиологическим раствором.
2.1.1. Экспериментальная модель токсического действия тяжелых
металлов у животных
Эффекты хлоридов кобальта и ртути исследовали в динамике 0,5 ч, 2 ч и 24 ч с
момента их воздействия в печени и почках крыс, отдельно в группах самцов и
самок. Животные были сгруппированы в соответствии с задачами эксперимента
следующим образом:
1 группа – контроль: крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,9
% NaCl), животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и 24 часа после инъекции;
2 группа – хлорид кобальта: 0,6% раствор CoCl2 · (H2O)6 вводили из расчета 3 мг
соли на 100 г массы животного [182], животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и
24 часа после инъекции;
3 группа – хлорид ртути: 0,1% раствор HgCl2 вводили из расчета 0,7 мг соли на
100 г массы животного [140], животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и 24 часа
после инъекции.
2.1.2. Модель оксидативного стресса хлоридом кобальта в условиях
блокады b-адренорецепторов пропранололом
В эксперименте были использованы 3 мес. крысы-самцы линии Вистар. Раствор
пропранолола вводили за 0,5 ч до инъекции хлорида кобальта. Животные были
сгруппированы следующим образом:
1 группа – контроль: крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,9
% NaCl), животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и 24 часа после инъекции;
2 группа – хлорид кобальта: 0,6% раствор CoCl2 · (H2O)6 вводили из расчета 3 мг
соли на 100 г массы [179], животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и 24 часа
после инъекции;
3 группа – пропранолол: 0,025% раствор пропранолола вводили из расчета 1,5 мг
на 1 кг массы [223], животных декапитировали через 1 ч, 2,5 ч и 24,5 часа после
инъекции;
4 группа – пропранолол + хлорид кобальта: раствор пропранолола вводили за 0,5 ч
до инъекции раствора хлорида кобальта (дозы вводимых препаратов были аналогичны
группам 2 и 4), животных декапитировали через 0,5 ч, 2 ч и 24 часа с момента
инъекции раствора хлорида кобальта.
Динамику исследуемых показателей изучали в печени и почках животных, гомогенаты
которых готовили как описано в главе 2.
2.1.3. Схема исследования возможных механизмов адаптивной роли
восстановленного глутатиона в условиях окислительного стресса
хлоридом кобальта
Работа была выполнена на 3 мес. крысах-самках линии Вистар. Окислительный
стресс моделировали, как и ранее, внутрибрюшинным введением раствора хлорида
кобальта в дозе 3 мг на 100 г массы животного. Контрольным животным вводили
соответствующий объем физиологического раствора. Динамику влияния СоСl2 на
равновесие ПОЛ«АОЗ исследовали через 0,5 ч, 2 ч и 24 ч с момента введения
раствора соли кобальта в печени и почках крыс. Раствор восстановленного
глутатиона (10%), рН=7,0, вводили также внутрибрюшинно в дозе 50мг на 100 г
массы животного [251] за 15 мин до введения хлорида кобальта. Группой сравнения
служили животные, которым вводили только раствор восстановленного глутатиона и
декапитировали через 15 мин, 45 мин и 2 ч 15 мин с момента инъекции.
Тритиоловый комплекс кобальта (раствор комплекса глутатиона с кобальтом в
соотношении 3:1 [3GS-Co3+]) вводили внутрибрюшинно из расчета 0,5 мл раствора
на 100 г массы. Животных декапитировали через 0,5 ч после инъекции. Комплекс
синтезировали in vitro [187], растворяя в физиологическом растворе сначала
восстановленный глутатион, а затем хлорид кобальта. В кислой среде комплекс не
образуется. При доведении pH раствора 2 N KOH до нейтральных значений
образовывался комплекс [3GS-Co3+], о чем свидетельствовали данные
спектроскопии. В полученном комплексе содержание кобальта соответствовало дозе
вводимого металла (2 мг на 100 г массы животного), а содержание
восстановленного глутатиона оказалось на порядок ниже используемой дозы GSH (5
мг на 100 г веса, по сравнению с 50 мг на 100 г массы животного), поскольку
количественное соотношение GSH : Co2+ равное 3:1 являлось определяющим для
образования тритиолового комплекса кобальта.
Схема эксперимента представлена на рис.2.1.
[3GS-Co3+]
Ї
30 мин t (время)
CoCl2
Ї 30 мин 2 ч 24 ч
15 мин Ї 45 мин Ї 2 ч 15 мин t (время)
GSH
Рис. 2.1. Схема экспериментального исследования адаптивной роли
восстановленного глутатиона в динамике окислительного стресса.
2.2. Получение сыворотки крови и приготовление гомогенатов тканей
Кровь собирали в сухие центрифужные пробирки и центрифугировали 15 мин при 3
тыс.обор./мин. Сыворотку отбирали в отдельные пробирки и использовали в
дальнейших определениях.
Брюшную полость животного быстро вскрывали, печень перфузировали охлажденным
физиологическим раствором. Из печени и почек готовили 20% гомогенаты на 40 мМ
фосфатном буфере (pH 7,4).
2.3. Определение содержания ТБК-активных продуктов в гомогенатах
тканей
Принцип метода заключается в том, что при высокой температуре (+100оС) в кислой
среде малоновый диальдегид реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой (
- Київ+380960830922