РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Нами вивчався ворсинчастий хоріон першого та другого триместрів вагітності від жінок, що знаходилися на обстеженні у відділенні медицини плода інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України. Досліджений матеріал було розподілено на наступні групи та підгрупи (табл. 2.1).
Контрольну групу спостережень становили 60 біоптатів ворсинчастого хоріона від здорових жінок віком 22-30 років з фізіологічним перебігом вагітності, в анамнезі яких була хромосомна патологія плода або деякі моногенні захворювання (група 1).
У 2 групу увійшли 120 біоптатів ворсинчастого хоріона від жінок віком 35-40 років з фізіологічним перебігом вагітності.
До 3 групи віднесено 60 біоптатів ворсинчастого хоріона від здорових жінок з фізіологічним перебігом вагітності віком 41-45 років.
Плоди жінок, що входили до 1,2 та 3 груп дослідження, не мали хромосомної патології та природжених вад розвитку.
Тридцять п"ять біоптатів ворсинчастого хоріона від жінок віком до 30 років, плід яких мав природжені вади розвитку центральної нервової системи (аненцефалія, гідроцефалія, екзенцефалія, спиномозкова грижа), котрі були встановлені при
Таблиця 2.1
Кількість вивченого матеріалу по групах та методи дослідження
Групи дослідженняМетоди дослідженняСвітлова мікроскопія
Електронна
мікроскопіяІмуногісто-хімічнийМорфометрич-ний Група 1
підгрупа "а"
підгрупа "б"
30
30
15
15
15
15
15
15
Група 2
підгріпа "а"
підгрупа "б"
60
60
15
15
15
15
15
15Група 3
підгрупа "а"
підгрупа "б"
30
30
15
15
15
15
15
15Група 4
підгрупа "а"
підгрупа "б"
15
20
10
15
10
15
10
15ВСЬОГО275115115115
ультразвуковому дослідженні і підтверджені при аутопсії, складали 4 групу досліджень.
Всі групи розподілено на дві підгрупи: у підгрупу "А" віднесено біоптати хоріона 10-12 тижнів гестації, у підгрупу "Б" - 20-22 тижнів гестації.
2.2. Методи дослідження
Біопсії хоріона виконувалися трансцервікально та трансабдомінально. Трансцервікальна біопсія хоріона за допомогою біопсійних щипців виконується при спорожненному сечовому міхурі. Під ультразвуковим контролем без розширення цервікального каналу вводять біопсійні щипці і просуваються за внутрішнє вічко до хоріона. Потім між стінкою матки та хоріоном бранші розкриваються, притискаються до хоріона, просуваються вперед на 1-2 мм, закриваються та виймаються. Одержана тканина ідентифікується за допомогою інвертованого мікроскопу.
Трансабдомінальна біопсія проводилася за допомогою бімануальної методики однією голкою 20G з мандреном при утворенні у 20-ти мл шприці з середовищем та гепарином негативного тиску (ультразвуковий датчик у заданому напрямку фіксує асистент). Технічні особливості залежать від терміну вагітності і розташування плаценти.
В першому триместрі найбільш сприятливим є напрямок руху голки при біопсії паралельно хоріальній пластині, що при малому терміні збільшує шлях голки і підвищує ефективність взяття зразка. Голка проходить крізь стінку матки, на 1-2мм заглиблюється у хоріон, а потім мандрен виймають, створюючи у шприці негативний тиск. Біопсія проводиться шляхом одночасного руху голки та всмоктування тканини. Після виймання голки, матеріал вимивають на чашку Петрі для подальшого дослідження.Той же бімануальний метод трансабдомінальної аспірації тканини плаценти використовують у другому триместрі вагітності.Техніка виконання процедури залежить від розташування плаценти. Одразу ж після забору частину біопсійного матеріалу фіксували у 10% водному розчині формаліну, зневоднювали у спиртах та заливали у парафінові блоки. Забарвлення зрізів проводилося гематоксилін - еозином та пікрофуксином за ван-Гізон. Мікроскопічні дослідження здійснювали за допомогою світлооптичного мікроскопу "Olympus" BM-2 (Японія).
Другу частину матеріалу занурювали у 2,5 % розчин глютаральдегіду з наступною фіксацією у 2 % розчині чотирьохокису осмію. Після зневоднення у спиртах та ацетоні, матеріал занурювали у суміш епону з аралдітом за загальноприйнятою методикою. З блоків на ультрамікротомі "Ultracut" готували напівтонкі та ультратонкі зрізи. Напівтонкі зрізи форбували піроніном та толуїдиновим синім. Звертає на себе увагу висока інформативність аналізу напівтонких зрізів ворсинчастого хоріона. Окрім огляду зрізу для електронної мікроскопії, ця методика має самостійне значення, бо вона дозволяє диференціювати синцитій та цитотро-фобласт у складі епітелія ворсин, усі елементи строми. Серійні ультратонкі зрізи контрастували уранілацетатом і цитратом свинцю. Ультратонкі зрізи вивчалися за допомогою електронного мікроскопу "ЕММА-4". Інформативними вважалися біоптати ворсинчастого хоріона, в яких містилося більше 50 ворсин.
Імуногістохімічні дослідження проводилися з використанням методу TUNEL.
Зрізи після депарафінування в ксилолах та зневоднювання у спиртах і промивання в бідистильованій воді, інкубували в термостаті в розчині протеїнази К та фосфатного буферу рН 7,2 протягом 15 хв. Далі проводилося промивання в бідістильованій воді, блокування ендогенної пероксидази спиртовим розчином Н2О2 протягом 30 хв., інкубація в суміші Apop Kit Peroxsidase Eguilibration Buffer та Apop Tag Kit Peroxidase Tdt Enzyme протягом 60 хв. при температурі 37 С, інкубація в розчині Apop Tag Kit Peroxidase Stop wosh Buffer протягом 30 хв. при 37 С, промивання фосфатним буфером три рази по 5 хв. та інкубація 30 хв. в Apop Tag Kit Peroxidase Anti Digoxigenic peroxidase при кімнатній температурі, промивання фосфатним буфером 3 рази по 5 хв., витримування в розчині діамінобензидину з трисбуфером рН 7,4 до утворення коричневого забарвлення в контрольних зрізах плацент