ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Данное исследование основано на комплексном изучении 60 наблюдений
искусственного прерывания беременности по социальным показаниям в сроках
гестации 20-27 недель (согласно приказу № 111 МЗ Украины от 28.06.1994г).
Сбор материала для патологоанатомического изучения осуществлялся в течение
1998-2001 гг. в прозекторских отделениях и родильных домах города Луганска.
Объем исследования составил 60 плодов, их почек и плацент, полученных в
различные сроки гестации, что позволило выделить 3 гестационных периода (1-й -
20-22 недели, 2-й - 23-25 недель, 3-й - 26-27 недель гестации) (табл.2.1).
Учитывая, что в каждом изученном гестационном периоде масса плода являлась
основным критерием задержки его развития, было выделено две подгруппы. Первая –
с ретардацией внутриутробного развития, где масса тела плода составляла
показатели ниже 10-го центиля (ЗВУР-1,2,3) и вторая – контрольная подгруппа,
где весовые показатели превышали отметку 10-го центиля, но были менее 90-го
центиля всей популяции плодов (К-1,2,3).
Материал для групп исследования получен от матерей без отягощенного
акушерского и гинекологического анамнеза при отсутствии тяжёлых соматических
заболеваний, т.е. с идиопатической ЗВУР.
В каждой гестационной группе исследование проводилось поэтапно, в соответствии
с единым алгоритмом.
Аутопсия плодов осуществлялась по методу Г.В.Шора. В каждом случае
регистрировались антропометрические данные плодов. Взвешивались правая и левая
почка, определялась средняя масса почек (СМП), средний их объем (СОП) и
относительная масса почек (ОМП) по формуле:
Таблица 2.1
Изученный материал по группам и методам исследования.
Сроки гестации
20-22 недели
I группа
23-25 недель
II группа
26-27 недель
III группа
Всего
Изученные группы
ЗВУР-1
К-1
ЗВУР-2
К-2
ЗВУР-3
К-3
Плод
антропометрия (к.н.)
аутопсия (к.н.)
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
60
60
Плацента
органометрия (к.н.)
10
10
10
10
10
10
60
Почки
плода
органометрия (к.н.)
макроскопия (к.н.)
гистология (к.н.)
иммуногистохимия (к.н.)
стереометрия (п.з.)
20
20
20
10
1600
20
20
20
10
1600
20
20
20
10
1600
20
20
20
10
1600
20
20
20
10
1600
20
20
20
10
1600
120
120
120
60
9600
Корреляционный анализ (к.н.)
10
10
10
10
10
10
60
Беременная
женщина
анамнез (к.н.)
10
10
10
10
10
10
60
Примечание: к.н. – количество наблюдений
п.з. – полей зрения
ОМП=
масса 2-х почек х 100 г. массы тела плода [28].
масса тела плода
Вычислялось отношение средней массы почек к массе плода (СМП/МП).
Кроме того, определялась масса плаценты (Мпц), вычислялись
плацентарно-плодовый коэффициент (ППК) и почечно-плацентарный индекс
(СМП/Мпц).
При макроскопическом изучении фетальных почек учитывалась их форма, окраска,
рельеф поверхности, консистенция. Регистрировались особенности капсулы.
После фиксации почек в течение 2-3 дней в 10% забуференном формалине они
рассекались продольно, по их длинной оси, на две части. Линия разреза проходила
фронтально через ворота почки, разделяя орган на две половинки. Исследовался
вид ткани на разрезе, визуально определялись особенности коркового и мозгового
слоёв. С одной половинки каждой почки брался 1 кусочек, заливался в парафин, и
срезы толщиной 4-7 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по
Ван Гизону, анилиновым синим по Маллори с использованием стандартных методик
[4, 62, 73]. Для выявления мукополисахаридов ставилась ШИК-реакция. Контрольное
окрашивание проводилось при предварительной обработке препаратов амилазой
слюны, бактериальной (стрептококковой) и очищенной тестикулярной гиалуронидазой
[73].
Полученные препараты использовались для гистологического исследования,
подсчета рядов клубочков и определения параметров коркового и мозгового слоёв
почек.
Со второй половинки каждой исследуемой почки было получено 250-300 серийных
срезов толщиной 4-5 мкм, каждый десятый из которых окрашивался гемотоксилином и
эозином и предназначался для стереометрического исследования гистологических
структур почек по методу серийной десекции [129, 166].
Для изучения особенностей развития соединительной ткани почек использовался
иммуногистохимический метод с использованием антител к коллагенам I, III, IV
типов [4].
При проведении иммуногистохимических реакций порядок операций осуществлялся по
следующей схеме [171] :
Депарафинизация и дегидратация ткани на предметном стекле.
Инкубация 3%-ным раствором перекиси водорода для блокирования эндогенной
пероксидазы – 10 минут.
Промывка и фиксация в фосфатном буфере (РВS-буфер) – 10 минут.
Блокирование неспецифических протеиновых соединений 1%-ым бычьим сывороточным
альбумином (BSA) – 30 минут.
Инкубация в термостате при температуре +37оС – 5 минут.
Промывка и фиксация в фосфатном буфере (РВS-буфер) – 10 минут.
Нанесение первичных антител к исследуемым антигенам, разведенных с PBS-буфером
1:50.
Инкубация в термостате при температуре +37оС – 1 час.
Промывка и фиксация в фосфатном буфере (РВS-буфер) – 3 раза по 10 минут.
Нанесение вторичных антител (по две капли на стекло).
Инкубация в термостате при температуре +37оС – 1 час.
Промывка и фиксация в фосфатном буфере (РВS-буфер) – 3 раза по 10 минут.
Нанесение комплекса стрептоидин-пероксидазы (по две капли на стекло).
Инкубация в термостате при температуре +37оС – 30 минут.
Промывка фосфатным буфером (РВS-буфер) – 5 минут.
Нанесение АЕС-хромаген-раствора (раствор для окраски) и инкубировать от 5 до 20
минут, контролируя интенсивность окраски под микроскопом.
Промывка дистиллированной водой.
Окраска