РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В ходе исследования предусмотрено использование экспериментального материала. Экспериментальное исследование позволит выяснить влияние на ткань легкого и ультраструктуру компонентов ССЛ (альвеолоцитов I и II типов) и АГБ на фоне ХАИ различной - 1, 3 и 6 месяцев, длительности, а также те изменения, которые возникнут при использовании при данной патологии ЗСТ естественным экзогенным сурфактантом "Сукрим".
2.1. Характеристика экспериментального материала
Работа выполнялась на базе вивария Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского. В эксперименте использовалось 110 половозрелых нелинейных экспериментальных белых крыс обоего пола с массой тела от 150 до 250 грамм, из которых 15 животных составляли контрольные группы в отношении действия ХАИ на ткань легкого (со сроками в 1, 3 ,6 месяцев), а 5 образовывали контрольную группу в отношении состояния ССЛ у здоровых экспериментальных животных, содержащихся в аналогичных условиях с животными на которых оказывались экспериментальные воздействия. Для гистологического исследования материал был взят у всех животных. Материал для электронной микроскопии, физико-химического и биохимического исследований также был взят у всех животных опытных и контрольных групп.
ХАИ моделировали путем внутрижелудочного введения зондом 40% раствора этилового спирта ежедневно, исходя из расчета 0,04 мг/г массы тела [98].
Острую бактериальную пневмонию моделировали интратрахеальным, введением 0,5 мл взвеси культуры золотистого стафилококка с концентрацией микробных тел 109 в 1 мл наркотизированным эфирным наркозом животным.
В качестве базовой терапии использовали в/м введение ампициллина из расчета 100 тыс./кг./массы тела в сутки, разделенное на два введения, начиная со 2-го дня после введения культуры микроорганизмов всем группам животных кроме контрольной.
ЗСТ осуществлялась отечественным препаратом естественного экзогенного сурфактанта "Сукрим" (Регистрационный №Р.04.00(01610)), для чего проводилась интубация трахеи крысы с последующим болюсным введением препарата из расчета 100 мг/кг массы тела. В среднем вводимый объем составлял 0,5 - 0,6 мл однократно.
Животные были разбиты на группы по 5 в каждой (Табл. 2.1.).
Таблица 2.1.
Распределение экспериментальных животных по группам.
Группы животныхОписание экспериментаК- здоровые животные без ХАИДлительность алкоголизации1 мес.3 мес.6 мес.ХАИ(1)ХАИ(3)ХАИ(6)- только алкоголизация в течение всего срока эксперимента.ХАИ(1)+ПН3ХАИ(3)+ПН3ХАИ(6)+ПН3- алкоголизация в течение всего срока эксперимента и моделирование пневмонии (забой на 3 день после введения культуры).Продолжение табл. 2.1.Группы животныхОписание экспериментаДлительность алкоголизации1 мес.3 мес.6 мес.ХАИ(1)+ПН7ХАИ(3)+ПН7 ХАИ(6)+ПН7- алкоголизация в течение всего срока эксперимента и моделирование пневмонии (забой на 7 день после введения культуры).ХАИ(1)+ПН+ЗСТ1(3)ХАИ(3)+ПН+ЗСТ1(3)ХАИ(6)+ПН+ЗСТ1(3)- алкоголизация в течение всего срока эксперимента, моделирование пневмонии и ЗСТ на 3-ий день после введения культуры; забой на 5-ый после введения культуры.ХАИ(1)+ПН+ЗСТ1(5)ХАИ(3)+ПН+ЗСТ1(5)ХАИ(6)+ПН+ЗСТ1(5)- алкоголизация в течение всего срока эксперимента, моделирование пневмонии и ЗСТ на 5-ый день после введения культуры; забой на 7-ой после введения культуры.ХАИ(1)+ПН+ЗСТ2ХАИ(3)+ПН+ЗСТ2ХАИ(6)+ПН+ЗСТ2- алкоголизация в течение всего срока эксперимента, моделирование пневмонии и 2-х кратная ЗСТ на 3 и 5 день после введения культуры; забой на 7-ой день после введения культуры.ХАИ(1)+ЗСТ+ПНХАИ(3)+ЗСТ+ПНХАИ(6)+ЗСТ+ПН- алкоголизация в течение всего срока эксперимента, моделирование пневмонии и ЗСТ за 1 сутки до моделирования пневмонии, забой на 3-ий день после введения культуры.
2.2. Морфологические методы исследования
Забой экспериментальных животных производился после тиопенталового наркоза декапитацией, после чего макроскопически исследовали и описывали легкие животных. Забор и вырезка материала для гистологического, электронно-микроскопического исследований осуществлялась у животных всех групп в кратчайшие сроки (20-40 минут) по единому плану.
2.3. Методика забора, фиксации и заливки материала для электронной и световой микроскопии
Световая микроскопия. Гистологическому исследованию подвергали фрагменты легочной ткани 110 экспериментальных животных. Для исследований брались участки легкого с наибольшими изменениями, по возможности без крупных бронхов и сосудов, преимущественно из нижних долей, размером 1х1х1 см. После этого данный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах восходящих концентраций с последующей заливкой в парафин. Окрашивали препараты гематоксилин-эозином и по ван-Гизону.
Препараты для трансмиссионной электронной микроскопии брались из участков легкого с наиболее выраженными изменениями тканей. С этой целью вырезались кусочки 1х1х1 мм.
Фиксацию и проводку осуществляли по следующей методике: вырезались кусочки размером 1х1х1 мм на восковой дощечке и фиксировались в 2,5% растворе глютаральдегида на фосфатном буфере (рH=7,2-7,4) на 1 час на холоду, после чего отмывались от фиксатора 0,1М фосфатным буфером 3 раза через 10, 20 и 30 минут, после чего заливались 1,5% раствором четырехокиси осмия на 1 час на холоду (+40). Проводили по спиртам восходящей концентрации: 25%, 30, 50% 5 и 10 минут, 70% спирт - на 2 часа или на ночь, 96% спирт - 2 раза по 25 минут, 100% спирт - 2 раза по 15 минут.
Обезвоживали ацетоном 2 раза по 15 минут. Заливали в смесь ацетон-смола из расчета 1:1 на 1 час с закрытыми пробками и на 1 час с открытыми пробками. Заливали в смолы Эпон-812, ДДСА, МНА
Полимеризацию осуществляли в термостате: при t(=37(С на ночь, при t(=45(С на день, при t(=56(С на ночь.
Материал для сканирую