РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Матеріали дослідження
Визначення діагностично-патоморфологічних маркерів вірусного та імуноклітинного ушкодження печінки, а також морфогенезу тяжкого фіброзу печінки при хронічних вірусних гепатитах В і С за даними трепанобіопсій проведено у 180 хворих, які склали 2 групи спостережень: 1 - а група - 40 хворих ХГВ (11 жінок і 29 чоловіків), 2 група- 140 хворих ХГС (41жінка і 99 чоловіків),групу умовного контролю склали 10 чоловік (4 жінки і 6 чоловіків) без клініко-біохімічних і патогістологічних ознак вірусного ураження печінки.
Вік обстежених хворих 1-ї групи спостережень коливався від 16 до 65 років, вік обстежених хворих 2-ї групи спостережень коливався від 19 до 68 років, вік групи умовного контролю коливався від 23 до 45 років. Середній вік хворих ХГВ склав 37 років, середній вік хворих ХГС - 39 років. Слід зазначити, що серед обстежених хворих ХГС і ХГВ частіше зустрічалися пацієнти чоловічої статі, що склали 70,71 % і 72,5% відповідно.
У групи спостереження відібрані тільки пацієнти, яким було проведене комплексне клініко-лабораторне і патоморфологічне дослідження трепанобіоптатів печінки.
2.2 Методи та методики досліджень
Для верифікації діагнозу відповідно до сучасного протоколу всім хворим проведено клінічне, лабораторне та інструментальне дослідження. Клінічне і лабораторне обстеження хворих проводилося в гепатологічному центрі Запорізької обласної інфекційної клінічної лікарні, пункційні біопсії печінки під контролем УЗД виконувалися в 1-му хірургічному відділенні 3-ої міської клінічної лікарні Запоріжжя. Етіологія вірусного гепатиту і фаза інфекційного процесу визначалися за допомогою імуноферментного методу і методу ампліфікації з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Хронічний гепатит В діагностували за наявності HBsAg, HBeAg, анти-HBc IgM, анти-HBc IgG, анти-HBe, ДНК HBV. Про активну реплікацію вірусу свідчила наявність в сироватці крові HBeAg, анти-HBc IgM і ДНК HBV. Хронічний гепатит С веріфікували за наявності в сироватці крові HCV IgG, анти-HCV IgM, і РНК HCV. Фаза реплікації вірусу у хворих ХГС визначалася за наявності в сироватці крові РНК HCV і анти-HCV IgM. Виразність синдрому цитолізу визначали на підставі виявлення в крові активності аланін- і аспартат-амінотрансферази (АлАТ, АсАТ).
У 3-й міській лікарні Запоріжжя лікарем хірургом виконувалася черезшкірна трепанобіопсія печінки голками Uni-Cut і BioCut 14-16G під контролем апарату УЗД Conbizon-320-5 Ultima-Pro-30 з використанням секторального і конвексного датчиків з ультразвуковою частотою випромінювання першого датчика 3-4 МГц, і 3,5 МГц - другого датчика. В результаті пункції одержували стовпчик тканини печінки, завдовжки не менше 1,5 см, що відповідало стандарту для подальшого повного і інформативного морфологічного дослідження трепанобіоптата.
Для патоморфологічного і імуногістохімічного дослідження стовпчики трепанобіоптатів печінки фіксували в забуференому 10% формаліні і заливали в парафін. На прецезійному ротаційному мікротомі НМ 3600 (фірми "MICROM Laborgerate GmbH" - Німеччина) виготовляли серійні зрізи завтовшки 3 ?м, які розміщали на звичайні предметні скельця (для стандартного патогістологічного фарбування) або на адгезивні предметні скельця "SUPER FROST PLUS" і "SUPER FROST PLUS GOLD" фірми "DAKO" - Данія (для імуногістохімічних досліджень).
Для мікроскопічного дослідження парафінові зрізи трепанобіоптатів печінки фарбували гематоксиліном і еозином (для виявлення основних патогістологічних змін), а також трибарвним методом Масона і методом ван-Гизон (для оцінки вираженості фіброзу печінки).
Ступінь активності і прогресії хронічного вірусного гепатиту в біоптатах печінки хворих оцінювали за індексом гістологічної активності (ІГА) Knodell R.G. зі співавт. (1981); виразність фіброзу печінки визначали за допомогою забарвлення ван-Гизон і трибарвного забарвлення Масона в градації METAVIR і Desmet V. зі співавт. (1995). Відповідно до вказаних вище градацій в біоптатах печінки розрізняли гепатит з мінімальною активністю (ІГА 1-3 бали), із слабко вираженою активністю (ІГА 4-8 балів), з помірною активністю (ІГА 9-12 балів) і з вираженою активністю (ІГА 13-18 балів), а також різний ступінь фіброзу печінки [F0 - відсутність фіброзу, F1 - слабкий фіброз портальних трактів, F2 - портальний фіброз з рідкісними септами в частках (помірний фіброз), F3 - множинні септи в частках без цирозу (тяжкий фіброз), F4 - цироз печінки)]. Для визначення ступеню вираженості фіброзу аналізувалася гістотопографія сполучнотканинних волокон і ступінь їх розвитку в печінці: наявність цих волокон в портальних трактах, наявність і ступінь вираженості фіброзу стінок центролобулярних вен, наявність внутрішньочасточкових фіброзних септ і порто-портальних фіброзних септ.
Наявність інфікування гепатоцитів вірусом гепатиту С визначали в парафінових зрізах непрямим імунопероксидазним методом з використанням антитіл до HBsAg і HBсAg та систем візуалізації DAKO EnVision. Для визначення кількості гепатоцитів, інфікованих вірусом гепатиту В, підраховували число HBsAg позитивних гепатоцитів в умовному стандартному полі зору мікроскопа при збільшенні 400.
Імуногістохімічне дослідження активованих зірчастих клітин Іто проводилося в парафінових зрізах з використанням моноклональних антитіл до А-ізоформи гладком'язового актину (А-SMA) і системи візуалізації DAKO EnVision.
Імуногістохімічне дослідження клітин Купфера проводилося в парафінових зрізах з використанням моноклональних антитіл до CD-68-антигену і системи візуалізації DAKO EnVision.
Активовані CD45R0+ Т-лімфоцити і CD8+ Т-кілери маркували в парафінових зрізах з використанням антитіл до CD45R0 і CD8 антигенів, а також системи візуалізації DAKO EnVision.
Імуногістохімічне дослідження колагену проводилося імунопероксидазним методом за допомогою моноклональних антитіл до колагену 4-го типу, а також сис