ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Общая характеристика клинико-анатомического материала
Для решения поставленных задач в настоящем исследовании использован клинико-анатомический материал, умерших от острой и хронической печеночной недостаточности, а также экспериментальный материал, полученный при моделировании ОПчН и ХПчН у животных.
Клинико-анатомический материал был получен в ходе 85 аутопсий, проведенных в Днепропетровских областных патологоанатомическом бюро и бюро судебно-медицинской экспертизы. Весь клинико-анатомический материал, в зависимости от причин смерти, был распределен на три группы:
1) 27 умерших (19 мужчин, 8 женщин в возрасте от 24 до 45 лет) от острой печеночной недостаточности, возникшей вследствие отравления дихлорэтилом и четыреххлористым углеродом;
2) 33 умерших (21 мужчина, 12 женщин в возрасте от 36 до 52 лет) от цирроза печени различного генеза в отечно-асцитической стадии. Распределение материала в зависимости от формы цирроза печени было следующим: портальный цирроз - 18 человек, постнекротический - 6, билиарный - 3, смешанный - 6. В большинстве случаев цирроз печени имел алкогольную либо неустановленную этиологию (соответственно 12 и 16 случаев), вирусную этиологию - в 5 случаях.
3) 25 умерших (11 мужчин, 14 женщин в возрасте от 38 до 44 лет) от различных причин, не имевших патологических изменений в системе легких и печени в качестве контрольной группы.
Вскрытие умерших производилось не позднее 4 часов с момента наступления смерти и осуществлялось в стандартных условиях.
2.2. Общая характеристика экспериментального материала
Данные экспериментального раздела работы использовали с целью анализа динамики структурно-функциональных изменений респираторного отдела и сурфактантной системы легких на различных этапах развития печеночной недостаточности, а также для исключения влияния патогенных факторов со стороны других органов и систем, не связанных собственно с острой или хронической печеночной недостаточностью.
Для воспроизведения модели печеночной недостаточности в работе были использованы 108 половозрелых белых крыс обоих полов, массой тела от 180 г до 240 г, полученные из вивария ДГМА и содержавшихся в стандартных условиях. Количественное распределение материала представлено в таблице 2.1.
1-я экспериментальная группа (n=20). Моделирование острой печеночной недостаточности проводили по методике G.R. Cameron [200] путем однократного внутрибрюшинного введения 40 % раствора четыреххлористого углерода (ССl4) в оливковом масле в дозе 0,5 мл раствора на 100 г массы тела животного.
2-я экспериментальная группа (n=64). Моделирование хронической печеночной недостаточности осуществляли по методике G.R. Cameron [200] при помощи внутрибрюшинного введения раствора ССl4 в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела крысы с частотой 1 раз в неделю на протяжении 16 недель. Материал легких и печени животных исследовали через 2, 4, 8 и 16 недель после начала эксперимента.
В качестве контроля (n=24) использовали животных, которым в течение 16 недель еженедельно внутрибрюшинно вводили 0,2 мл оливкового масла.
В течение эксперимента все животные находились на обычной лабораторной диете.
Перед эвтаназией животных не кормили в течение 1 суток. Забой крыс во всех группах осуществляли через 48 часов после окончания эксперимента, под кратковременным (1 мин) эфирным наркозом, путем пересечения брюшного отдела аорты [15].
2.3. Морфологические методы исследования
Для проведения морфологического исследования правое легкое умерших и экспериментальных животных фиксировали интратрахеальным введением 10% раствора нейтрального формалина под давлением, близким к естественному - 15-20 мм. вод. ст. После фиксации и тщательного макроскопического исследования производили вырезку фрагментов легочной ткани, не содержащих крупных сосудов и бронхов, из верхних (1-й сегмент), средних (3-й сегмент) и нижних (10-й сегмент) отделов легких умерших для объективизации полученных результатов и нивелирования ошибок в их интерпретации, причем правое легкое экспериментальных животных использовали целиком. Материал левого легкого использовали для проведения электронно-микроскопического, физико-химического и биохимического исследования. Фрагменты печени иссекали из субкапсулярных и глубоких участков правой и левой долей (по 4 образца из каждой).
После фиксации образцы легких и печени заключали в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 5-7 мкм обрабатывали следующими красителями: гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, по Маллори, по Гомори, по Прантеру [78, 253, 298, 319].
Для электронно-микроскопического исследования забор образцов левого легкого производился не позднее 4 часов после смерти, а экспериментального материала - непосредственно после забоя животных. Изготовление ультратонких срезов проводили на ультрамикротоме УМТП-5-М и "Reichert" (Австрия) из блоков, залитых в эпон-аралдит [356]. Для изготовления блоков кусочки ткани объемом около 1 мм3 фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), в течение 2 часов при комнатной температуре. Дофиксацию проводили 1 % раствором четырехокиси осмия на том же буфере в течение 2 часов. После обезвоживания кусочки ткани заключали в смесь эпона и аралдита согласно рекомендациям Weekly [356].
Срезы контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу. Исследование проводили на электронном микроскопе TESLA BS 500 (Чехия) и ЕМ-100 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и первичных увеличениях от 2000 до 50000. В целом, электронно-микроскопическое исследование проводили по схеме, предложенной В.Я. Карупу [56].
Проведение количественного морфологического исследования основывали на общих принципах стереометрического анализа, изложенных Г.Г. Автандиловым [2-5], А.А. Арбузовым с соавторами [16] и А.Ф.Киселевой с сотрудниками [78].
Для патоморфологическ