ГЛАВА 2
Материал и методы исследования
2.1. Характеристика экспериментального материала
В качестве материала исследования использовали легкие 48 беспородных половозрелых белых крыс массой 180-200 г из вивария Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского, которых содержали в стандартных условиях в соответствии с рекомендациями И.П. Западнюка с соавт. [62]. Выбор вида животных для эксперимента мотивирован данными литературы [3, 9, 62], подтверждающими, что отравление крыс этанолом адекватно моделирует морфогенез патологии человека.
Острую алкогольную интоксикацию моделировали на 40 крысах по методике В.А. Кононяченко с соавт. [74], согласно которой 40 % раствор этанола вводился внутрижелудочно однократно с помощью полихлорвинилового зонда из расчета 0,04 мл на 1 грамм массы животного (0,016 мл/г чистого 96% этанола). Животные были распределены по срокам наблюдения: 15 минут, 30 минут, 1 час, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа и 3 суток после однократного введения этилового спирта, что позволило хронологически проследить динамику морфологических изменений в легких в условиях ОАИ и учитывать особенности метаболизма этанола в организме в фазах резорбции и элиминации.
Контрольную группу составили 8 животных, которым также внутрижелудочно вводили 6-7 мл водопроводной воды с целью воссоздания чистоты эксперимента.
Структура экспериментального материала представлена в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Распределение экспериментальных животных
по группам наблюдений
Наименование группКоличество животныхконтрольная группа8ОАИ:
15 мин.
30 мин.
1 час
3 часа
6 часов
12 часов
24 часа
3 суток
5Всего48
Для чистоты эксперимента, чтобы избежать влияния других психоактивных веществ на легкие, кроме этанола, крыс забивали без наркоза методом декапитации с использованием гильотинирующего механизма [115], что позволило избежать выраженной сосудистой реакции в исследуемых органах подопытных и контрольных животных.
После вскрытия грудной полости производилось двустороннее удаление легких. Объектом исследования служили удаленные легкие крыс, из которых иссекались кусочки для гистологических и физико-химического методов исследования, электронной микроскопии, иммуногистохимии.
2.2. Характеристика секционного материала
Материалом секционной части работы послужили легкие 75 трупов лиц обоего пола в возрасте от 18 до 45 лет.
Отбор материала для исследования производился на базе отдела экспертизы трупов Крымского республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы.
К группе острого отравления этиловым алкоголем были отнесены 65 случаев, в которых уровень алкоголемии составлял 5 и более промилле, что принято считать смертельным в соответствии с "Методическими указаниями Министерства здравоохранения СССР о судебно-медицинской диагностике смертельных отравлений этиловым алкоголем и допускаемых при этом ошибках" и рекомендациями В.И.Прозоровского с соавт. [140, 141, 142].
Контрольную группу составили 10 трупов лиц обоего пола в возрасте от 18 до 40 лет, у которых алкоголь в крови и моче не определялся общепринятыми методиками, отсутствовал вероятный алкогольный катамнез и наличие заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем, а причиной смерти явились механические повреждения, за исключением травмы легких. Структура секционного материала представлена в табл. 2.2.
Таблица 2.2
Распределение секционных наблюдений по группам
Группы
наблюденияЧисло
случаевУровень алкоголемии (промилле)Возраст
(лет)контрольная группа10-18-40острое отравление алкоголем65
5,06 - 10,0319-45
Срок изъятия материала колебался от 6 до 24 часов после констатации биологической смерти в условиях хранения тел в холодильной камере.
2.3. Методы исследования
При обработке и анализе материала использован комплексный подход.
После вскрытия грудной клетки и извлечения органов грудной полости производили макроскопическую оценку легких. Затем легкие животных освобождали от крупных сосудов и бронхов в области корня. Далее вырезали кусочки ткани обоих легких размерами 1см х 1см х 1см, предназначенные для гистологического исследования, с последующей фиксацией в 10% растворе нейтрального формалина. Минимальный срок фиксации составил 10 дней, в течение которых фиксирующая жидкость сменялась дважды. Фиксатор отмывали в проточной водопроводной воде 24 часа. Ткань легких крыс обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 % - 1, 96 % - 2 и абсолютный спирт), просветляли в ксилоле, выдерживали в насыщенном при +37°С растворе парафина в ксилоле, помещали в парафин при +56°С, с последующей заливкой в смесь парафина и пчелиного воска и изготовлением парафиновых блоков [88, 129]. Из парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4-5 мкм.
Секционный материал обрабатывали таким же образом.
С целью обзорной окраски, а также для выявления компонентов соединительной ткани, фибрина гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, по Маллори-Слинченко, по методу Вейгерта [88, 146, 150, 229]. Кроме того, в ряде случаев для получения дополнительной информации, а также прицельной заточки капсул из блоков, подготовленных для изготовления ультратонких срезов на ультратоме УМПТ-7, готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего с добавлением в равной пропорции 1% раствора тетрабората Na (бура). Срезы просматривали и фотографировали в микроскопе МБИ-15-2-Г.
Препараты для трансмиссионного электронно-микроскопического исследования брались из участков легкого с наиболее выраженными изменениями тканей.
Фиксацию и проводку осуществляли по следующей методике:
1. Вырезали кусочки размерами 1х1х1 мм на восковой дощечке и фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на