РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені морфологічні дослідження зразків пухлинної тканини та клініко-морфологічні співставлення у 136 пацієнтів, які були прооперовані в Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України з приводу МБ мозочка з 2000 по 2006 р. У тому числі були включені 11 пацієнтів, які перенесли першу операцію раніше, але в цей період поступили повторно у зв'язку з продовженим ростом пухлини чи появою метастазів.
2.1. Загальна характеристика спостережень
Аналіз клінічних та інструментально-лабораторних показників проводився на підставі записів в медичній документації (історія хвороби і амбулаторна карта пацієнта). Cеред пацієнтів - 86 чоловіків та 50 жінок (співвідношення чоловіків та жінок 1,72:1); 97 пацієнтів у віці від 7 місяців до 17 років (71,3%) та 39 пацієнтів 18-48 років (28,7%) (рис. 2.1) Медулобластоми частіше зустрічались у дітей, найбільша кількість випадків виявлялась у інтервалі від 6 до 9 років. Середній вік дітей хворих на МБ - 7,9 років, медіана 7 років. Серед наших спостережень не було жодного випадку захворювання у новонароджених та у осіб літнього віку. У дорослих майже 2/3 усіх випадків були вперше встановлені у віці 16-25 років. В 97 випадках пухлина локалізувалась в задній черепній ямі по середній лінії (черв'як мозочка, ІV шлуночок), в 39 випадках - вона розташовувалась виключно в одній з півкуль мозочка.
Рис. 2.1. Розподіл пацієнтів з медулобластомами мозочка за віком
Всім хворим проводилось хірургічне лікування, відповідно до принципів, які прийняті в сучасній нейроонкологічній практиці, метою якого було видалення пухлини та відновлення ліквороциркуляції.
2.2. Критерії оцінки клінічних даних
Об'єм хірургічного видалення пухлини оцінювався за даними протоколу операції та результатами післяопераційної комп'ютерної томографії та/або МРТ-дослідження.
Для визначення радикальності видалення пухлини користувались класифікацією за Albright A. (1996) [340], відповідно до якої виділяли чотири ступені: тотальне видалення (пухлина видалена в межах незміненої мозкової речовини, за даними КТ/МРТ залишкова пухлина не виявляється); майже повне видалення (залишена тонка смужка пухлини на поверхні дна ІV шлуночку, але на КТ пухлина не візуалізується); субтотальне видалення (за даними КТ/МРТ визначається пухлинна тканина 10-50% від початкового об'єму); часткове - (за даними рентгенологічного дослідження пухлина становить більше 50% початкового об'єму). За вищевказаними критеріями тотальне видалення було виконане в 51%, майже повністю пухлина була видалена в 29%, субтотальну резекція ?19% та часткове в 1% спостережень.
Для топографо-анатомічної характеристики росту МБ та поширеності первинного метастатичного ураження використовувалась загальновживана в нейроонкологічній практиці класифікація за Chang [127].
2.3. Методи морфологічного дослідження
Матеріал біопсій для гістологічного та імуногістохімічного дослідження, відразу після доставки, фіксувався на в 10% розчині нейтрального формаліну, охолодженого до температури +4°С. Тривалість фіксації визначалась в залежності від розмірів шматочків пухлини та становила від 12 до 24 годин. Після фіксації проводилась стандартна проводка і заливка матеріалу в парафін. Отримані з парафінових блоків мікротомні зрізи товщиною 5-8 мкм переносились на предметні скельця та фарбувались [14, 40, 46, 66, 72, 74].
Для цитологічного та цитогенетичного дослідження готувалися препарати-відбитки пухлинної тканини з нефіксованого біоптичного матеріалу [14, 40, 66].
Для електронно-мiкроскопiчного дослiдження фрагменти пухлинної тканини розміром 1х1мм3 забиралися відразу після доставки біоптичного матеріалу чи під час аутопсії, фіксувалися в суміші 4% параформальдегіда, 2,5% глютаральдегіда і 4% сахарози на 0,1 молярному фосфатному буфері рН=7,4 з наступною дофіксацією в 1% розчині чотирьохокису осмію [46].
Загальна гістоархітектоніка пухлини оцінювалась за оглядовими препаратами забарвленими гематоксиліном та еозином. На основі їх вивчення відбиралися фрагменти для подальшого гістохімічного та імуногістохімічного дослідження. Сполучнотканинні структури візуалізувались методом Ван - Гізона (забарвлення гематоксиліном та пікрофуксіном) [14, 40]. Сріблення за Гоморі дозволяло диференціювати серед них ретикулярні (аргірофільні) волокна [40, 46, 66]. Для виявлення ядер нервових та гліальних клітин їх ядерець та специфічних цитоплазматичних включень використовувалось забарвлення тіоніном за Нісселем [40, 46, 66].
Виконувалось, загальновживане для цитологічних препаратів, паноптичне забарвлення за Папенгеймом і паралельно проводилось фарбування гематоксиліном та еозином, що давало можливість більш коректного їх співставлення з гістологічними препaратами [14, 40, 66]. Для цитогенетичних досліджень (виявлення ядерцевих організаторів і клітин у стані апоптозу) використовувався метод сріблення за Хоуел-Блеком [45].
Визначення проліферативної активності пухлинних клітин здійснювалось шляхом виявлення нуклеопротеіну Кі-67 непрямим імуногістохімічним пероксидазним (DAB) методом. Антиген Кі-67, як відомо, приймає участь в усіх фазах мітотичного циклу, його експресія починається в середині G1-фази, поступово наростає та досягає максимального значення у мітозі, при завершенні якого швидко катаболізується [21].
Імуногістохімічні дослідження виконувалось на серійних мікротомних зрізах з парафінових блоків, з середньою площою не менше 1 см?. Зрізи помішались на небілкові адгезивні скельця вкриті полізіном (Мenzel-Glaser, США). Використовувалась DACO EnVision+System, Peroxidase (DAB), дослідження проводилось відповідно до інструкції по використанню набору, яка додавалась до набору реактивів для забарвлення з розрахунку на на 50 тканинних об'єктів. Виявлення антигена Кі-67 проводилось за допомогою мишачих анти-людський ан