РОЗДІЛ 2
Об’єкт, матеріали та методи досліджень
Характеристика штамів. Штами культур Escherichia coli люб’язно надані: AB1157
та KS400 – д-ром Андрєєвою І.В. (Інститут епідеміології та мікробіології ім.
Гамалеї РАМН, Росія); AB1157 – д-ром Демплом Б. (Гарвардський університет, США)
та д-ром Імлаєм Дж. (Ілінойський університет, США); В23, МР180, UM120, UM202 –
д-ром Лоевеном П. (Манітобський університет, Канада); MC4100, GS071 – д-ром
Шторц Г. (Національний інститут здоров’я дітей та розвитку людини, США).
Генотип та походження штамів наведені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Генетична характеристика штамів E. coli, які використовували в роботі
Штам
Генотип та відповідні характеристики
Ким та коли виділений
KS400
АВ1157
MP180
UM120
UM202
B23
МС4100
GS071
Дикий тип К12, metB
Дикий тип К12, F- thr-1 leuB6 proA2 his-4 thi-1 argE2 lacY1 galK2 rpsL supE44
ara-14 xyl-15 mlt-1 tsx-33
Дикий тип К12, HfrH thi-1
MP180 katE12::Tn10
MP180 katG17::Tn10
Дикий тип В
araD139 relA1 thi rpsL150 flbB5301 D(lacU139) deoC7 ptsF25
MC41000 DsoxRS-zjc2205 zjc2204::Tn10kan
1972, Андрєєва (СРСР)
1962, Hovard-Flanders (США)
1972, Pearson (США)
1985, Loewen (Канада)
1984, Loewen (Канада) 1982, Richter (Канада)
1984, Trun (США)
1999, Storz (США)
Реактиви. В роботі використовували реактиви виробництва фірм “Sigma“ (США),
“Reanal” (Угорщина), “Lachema” (Чехословаччина) та “Реахім”(СРСР) найвищого
доступного ступеня чистоти.
Живильні середовища. Культури Е. соlі вирощували в середовищах виробництва АОЗТ
“Макрохім” (м. Київ, Україна), що містило 4,32 г/л суміші амінокислот, 5,44 г/л
ферментативного пептону, 5,11 г/л хлориду натрію, 0,13 г/л карбонату натрію, а
також виробництва НПО “Питательные среды” (МОЗ Росії, м. Махачкала), до складу
якого входили 10,05 г/л панкреатичного гідролізату кільки та 4,95 г/л хлориду
натрію (рН 7,0). Середовище стерилізували автоклавуванням в паровому
стерилізаторі ВК-75 (СРСР) за температури 121°С протягом 20 хв.
Умови культивування. Для досліджень відповідні об’єми нічної культури,
вирощеної в умовах глибинного культивування (стаціонарна фаза) розводили 1:100
стерильним бульйоном та інкубували при 37°С протягом відповідного часу: 17-18
год (стаціонарна фаза) і 4-5 год (середина експоненційної фази). Бактерії
вирощували за таких умов:
- глибинне культивування (умови наближені до анаеробних);
- культивування в середовищі, барбітованому стерильним
повітрям, з використанням мікрокомпресора (аеробні умови);
- культивування в середовищі, барбітованому медичним киснем (оксигенація).
Підготовка досліджуваних препаратів. Після досягнення культурою необхідної фази
росту клітини збирали центрифугуванням при 3000 g протягом 10 хв на центрифузі
РС-6 (СРСР) або К-24D (Німеччина). Бактерії двічі промивали 50 мМ
калій-фосфатним буфером з 0,5 мМ ЕДТА (рН 7,0) та ресуспендували у відповідному
об’ємі того ж буферу. При розведенні робочої суспензії інтактних клітин в 100
разів oптична густина цієї суспензії при довжині хвилі 600 нм становила
0,25-0,3 одиниці, що відповідало приблизно 107 клітин/ мл.
Клітини руйнували обробкою ультразвуком частотою 22 кГц протягом 5-8 хв за
допомогою дезінтегратора УЗДНТ-2Т (СРСР) при температурі 4°С. У дослідах, в
яких досліджували функціональні властивості каталази, перед ультразвуковою
обробкою бактерії заморожували при -5°С протягом 15-20 год. Для отримання
гомогенного екстракту клітин суспензію після обробки ультразвуком
центрифугували при 4000 g та температурі 4°С протягом 10 хв. Після цього осад
відкидали, а супернатант використовували для досліджень, протягом яких його
зберігали на льоду.
Створення оксидативного стресу. Для дослідження впливу оксидативного стресу
культуру клітин вирощували при 37°С, рН 7,0 в умовах аерації протягом 4-5 год
(середина експоненційної фази) до досягнення оптичної густини при довжині хвилі
600 нм приблизно 0,45 одиниць. Після цього отриману культуру розводили в чотири
рази свіжим бульйоном, нагрітим до 37°С. Відбирали аліквоти отриманої
суспензії, до якої додавали 5-100 мкМ (всюди вказані кінцеві концентрації)
пероксиду водню або 1 мкМ ФМС (феназинметасульфату) з наступною інкубацією при
37°С протягом відповідних проміжків часу до 60 хв. Після цього клітини
осаджували центрифугуванням, промивали і готували до досліду як було описано
вище.
Підрахунок клітин. Кількість життєздатних бактерій визначали методом серійних
розведень, підраховуючи кількість колоній після інкубації розведених культур на
твердому поживному середовищі при 37°С [9].
Криві росту. Нічну культуру відповідного штаму розводили стерильним середовищем
в 100 разів. Отриману супензію культивували за умов описаних вище. Через певні
проміжки часу відбирали аліквоти вирощуваної культури і спектрофотометрували
при довжині хвилі 600 нм на спектрофотометрі СФ-46 (СРСР). Криві росту виражали
як функцію величини поглинання світла суспензією бактерій. Розрахунок часу
подвоєння бактерій та часу лаг-фази проводили за формулами [6]:
(t1-t2).lg2 T.(lgOD2-lgOD1)
T= ѕѕѕѕѕ та L= t1-t2 + ѕѕѕѕѕѕѕѕ,
lgOD2-lgOD1 lg2
де Т - час подвоєння кількості бактерій,
t1-t2 - час лінійного періоду експоненційної фази, хв,
OD1 і OD2 - значення оптичної густини при довжині хвилі 600 нм, які
відповідають часу t1 і t2,
L – продовженість лаг-фази, хв.
Визначення активності ферментів. Активність ферментів визначали
спектрофотометричним методом при температурі 25°С за допомогою спектрофотометра
СФ-46 (ЛОМО, Ленінград, СРСР), обладнаного термостатованим кюветоутримувачем.
Каталаза. Використовуючи властивість молекул
- Київ+380960830922