Раздел 2
Объекты и методы исследований
Учитывая цель работы, направленной на установление эффективности влияния новых
производных фенилоксалуровой кислоты на процессы ПОЛ, АОС, обмена липидов,
острофазных белков, аминов и ферментов цитолиза, осуществляли выбор объектов и
методов исследований. В начале химическую структуру новых веществ исследовали с
помощью компьютерных программ Chembase и ОРАКУЛ на компьютере IBM
PS/14МВ/170МВ, с целью поиска аналогов известных лекарственных веществ в
химической структуре и выявления перечней предполагаемой биологической
активности КФК и К-4-ЭФК при введении животным [196, 297].
Для достижения поставленной цели необходимо было исследовать способность новых
веществ влиять на содержание в сыворотке крови ДК и МДА, чтобы определить
состояние процессов ПОЛ, на активность каталазы, СОД, ВГ и церулоплазмина,
чтобы характеризовать состояние процессов АОС, на содержание общих липидов и
холестерина, чтобы характеризовать общее состояние обмена липидов, на
содержание общего белка и фибриногена, на активность АлАТ, АсАТ, ЩФ и КФ,
чтобы характеризовать общее состояние обмена белков (в т.ч. острофазных) и
ферментов цитолиза, а также состояние клеток печени и других внутренних
органов, на содержание гистамина и серотонина, чтобы характеризовать состояние
обмена медиаторов воспаления. Для изучения всех этих показателей требовалось
относительно много крови, и поэтому в качестве экспериментальных животных были
взяты крысы, широко используемые в экспериментах и имеющие достаточный объем
крови [64, 65, 230].
Изучение адаптогенной активности новых веществ осуществляли в соответствии
с известными рекомендациями, в том числе, с указаниями компетентных
специалистов МЗ Украины [71].
Для характеристики состояния процессов ПОЛ определяли в сыворотке крови
содержание первичных продуктов липопероксидации. Они образуются в результате
поступления в ткани при действии чрезвычайных стимуляторов большого количества
свободных кислородных радикалов (супероксидного аниона У2–, пероксидного НУ2,
синглетного кислорода (1У2–), перекиси водорода Н2О2, гидроксильного
радикала УН), которые, обладая высокими реакционными способностями,
взаимодействуют с разными молекулами, а особенно с полиненасыщенными жирными
кислотами мембран клеток, насыщают свои валентности и стабилизируются: НУ2+RH
> Н2О2+А. На этих первых стадиях окисления липидов кислородными радикалами
образуются перекисные радикалы: А+O2>ROУ, а перекисные радикалы реагируют с
молекулами ненасыщенных жирных кислот и способствуют образованию свободных
радикалов жирных кислот и гидроперекисных радикалов: ROУ+RH >ROOH+А (количество
гидроперекисей достигает 92–98% от всех продуктов окисления) ненасыщенных
жирных кислот с увеличением числа двойных связей и с образованием молекул с
двумя сопряженными двойными связями, так называемыми ДК: . В результате этих
реакций в мембранах клеток, содержащих относительно много легкоокисляемых
фосфолипидов, могут образовываться оголенные участки «поры», через которые из
цитоплазмы могут выходить не только молекулы, но и органеллы, что является
основой для цитолиза [129, 152]. Так как в биомембранах клеток на первой стадии
действия чразвычайных стимуляторов окисляются преимущественно
полиненасыщенные жирные кислоты с образованием гидроперекисных радикалов, то
определение в сыворотке содержания ДК объективно отражает интенсивность реакций
ПОЛ. Принцип метода определения ДК в сыворотке основан на способности молекул
полиненасыщенных жирных кислот образовывать на стадии свободных радикалов
систему сопряженных двойных связей, имеющих максимум поглощения при длине волны
233 нм [95], для чего применяли регистрацию на спектрофотометре СФ-46.
Гидроперекиси липидов и иные нестойкие первичные продукты ПОЛ относительно
быстро преобразуются с формированием вторичных продуктов в виде альдегидов,
кетонов, спиртов, эпоксидов, одним из которых является МДА:
МДА способен легко реагировать с группами SH- и СН3- ферментов, угнетая к
примеру, тканевое дыхание в клетках (при реакции с цитохромоксидазой), нарушая
процесс превращения холестерола в желчные кислоты (ингибируя активность
гидроксилаз), а реагируя с аминогруппами белков, изменяет строение эластических
волокон альвеол легких с нарушением функций аэрогематического барьера. Продукты
ПОЛ понижают синтез простагландинов, формируют синдром с увеличением
проницаемости клеточных мембран, угнетают деление и регенерацию клеток. МДА
способен реагировать с аминогруппами фосфолипидов, в результате чего образуются
основания Шиффа, относящиеся к конечным продуктам ПОЛ. Учитывая динамическую
закономерную стабильность содержания МДА в сыворотке у здоровых животных, его
зависимое возрастание при активации ПОЛ в процессе действия разных факторов,
можно считать, что этот биохимический показатель всегда объективно отражает
интенсивность пероксидации липидов, и поэтому соответствует задачам работы.
Применяли метод определения вторичных продуктов ПОЛ, в основе которого
находится реакция МДА с тиобарбитуровой кислотой [95], регистрацию результатов
которой осуществляли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны л=532 нм.
Для характеристики состояния АОС определяли активность СОД, каталазы, ВГ и
церулоплазмина. Все клетки организма содержат СОД, которая катализирует процесс
десмутации О2–, предохраняя нормальные молекулы от токсического действия
кислорода и преобразуя его в пероксид водорода. Цитозольный изофермент СОД
состоит из двух субъединиц, содержащих Сu2+ и Zn2+ , а в митохондриальный
изофермент входит ион Mn2+. СОД как эффективный антиоксидант
- Київ+380960830922