РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні моделі дослідження, що використовуються
Встановлені мета та задачі потребують постановки відповідних моделей та
використання методів дослідження, які є досить інформативними та дозволяють
провести ретельний аналіз макромолекулярного складу сироватки крові при
відповідних патологіях.
Початковим необхідним етапом досліджень є аналіз ЛК-спектрів основних
компонентів сироватки крові у монокомпонентних розчинах для вдосконалення їх
біофізичних характеристик, з одного боку, та тестування ЛК-спектрометра, з
іншого.
З метою вирішення встановленої задачі в експерименті було обрано наступні
експериментальні моделі.
Для проведення досліджень in vitro із аналізом структури компонентів сироватки
крові на ЛК-спектрометрі з сухих фракцій альбуміну, глобуліну, протромбіну,
люб'язно наданих Одеською обласною станцією переливання крові (серії № 23 467,
47 587, 22 377 відповідно) готували 10 % розчин при розведенні 0,9 % розчином
NaCl ex tempore відповідно до методичних рекомендацій [174] . Одну серію
пробірок містили в термостат (37,7 єС), іншу залишали при кімнатній температурі
20,0 єС. Вимірювання ЛК-спектрів проводили на 10, 20, 30 хвилини після
розчинення.
Для визначення спектральних характеристик в реакціях антиген-антитіло в
пробірці змішували сироватку здорових донорів (контроль) та хворих із
відповідною патологією та моноспецифічну сироватку проти імуноглобуліна M за
серією 31 047 (виробництво НИИЭВ им. Н.Ф. Гамалеи, г.Москва) у розведенні 1:10.
Реакційну суміш досліджували через 10 хвилин, 1 та 2 год.
Попередньо проводили аналіз окремо сироватки крові здорових донорів, хворих та
моноспецифічну сироватку проти імуноглобуліна М на 3, 7, 10 хвилини дослідження
з метою встановлення часу найбільшої стабілізації реакційних компонентів та
початку конформаційних змін, які призводять до змін біофізичних характеристик
реакційної суміші.
Модель розвитку реакцій первинної та вторинної імунної відповідей вивчалась при
введенні чужорідного антигену; модель запальної реакції - на прикладі
розвинення експериментального калового перитоніту; моделювання
імунодепресивного стану проводили з використанням цитостатиків -
6-меркаптопурину та метотрексату. Усі експериментальні дослідження здійснювали
на статевозрілих щурах масою від 120 до 150 г, тварини знаходились в звичайних
умовах віварію на повноцінному харчовому раціоні. Після закінчення експерименту
під легким ефірним наркозом тварин забивали шляхом одномоментної декапітації
відповідно з усіма вимогами ВООТ щодо використання тварин в експериментальних
дослідженнях.
Для вивчення реакцій первинної та вторинної імунної відповіді тваринам уводили
внутрішньоочеревно 5,0ґ109 еритроцитів барана (ЕБ) (0,5 мл, 50 % розчину),
попередньо відмитих у фізіологічному розчині. Декапітацію тварин здійснювали на
1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 доби первинної імунної відповіді. На 15 добу щурам
додатково (вторинно) вводили еритроцити барана в кількості 5,0Ч104 (0,5 мл, 25
%) та аналізували сироватку на протязі перших 6-ти діб розвинення реакцій
вторинної імунної відповіді.
Використання даної моделі для вивчення імунологічних реакцій пояснюється
наступним: по-перше, модель проста в здійсненні та чітко відображає основні
етапи формування імунної відповіді на введення чужорідного антигену; по-друге,
саме на цій моделі було проведено велику кількість досліджень сироваткового
гомеостазу зі встановленням стану клітинної та гуморальної ланок імунної та
інших систем організму, що надає можливість використовувати ці данні в
порівнянні з власними результатами нових запропонованих методів дослідження
[82, 83, 175 ].
Для моделювання гострого розповсюдженого запального процесу використовували
добре відому модель, яка була запропонована І. І. Дерябіним [176].
Щурам одноразово внутрішньоочеревно вводили 30 % розчин калової суміші через 10
хвилин після попереднього введення 20 % розчину скіпідарової емульсії на
вазеліновій олії в дозі 0,5 мл. Забої тварин здійснювали на протязі перших 5
діб розвитку перитоніту.
Обрання відповідної моделі пояснюється можливістю спостереження за розвитком
гострої запальної реакції, яка має місце вже через 12 годин після ін'єкції та
на першу добу експерименту має розвинені характеристики, що дозволяє
спостерігати за розвитком відповідних стадій перитоніту та більш віддаленими
процесами патофізіологічної адаптації до гострозапального процесу в тварин, що
залишилися живими, на подальших строках експерименту.
Зокрема, остаточний вибір моделі обумовлено попереднім ретельним вивченням в
експериментальній медицині патоморфологічних, біохімічних, імунологічних змін,
які мають місце при цій патології. Однак, залишаються деякі питання про
загальні зміни гомеостазу, несвоєчасне виконання та недостатня інформативність
аналізів не дозволяє з високим ступеням точності встановити стадійність
процесу, позбавляє можливості найскорішого впровадження відповідної терапії та
залишає перитоніт однією з найскладніших патологій з високим ступенем
летальності [26,35,36,38,60].
Для спостереження за реакціями імунодепресивного характеру використовували
6-меркаптопурин та метотрексат. Обрання для експерименту цих двох відомих
цитостатиків базується на тому, що останні широко використовуються в практичній
медицині, відіграють провідну роль у лікуванні онкологічних хворих,
трансплантології, для гальмування реакцій відторгнення трансплантату, в
лікуванні автоімунних захворювань тощо.
Загальним найважливішим їх недоліком є відсутність вибірковості дії та висока
гепатотоксичність, що призводять до по
- Київ+380960830922