РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Загальна характеристика обстежених осіб
Під наглядом знаходилось 259 дітей, хворих на гостру пневмонію, в тому числі 137 (52,9 %) хлопчиків і 122 (47,1 %) дівчинки у віці від 2 до 14 років, які знаходились на лікуванні у відділенні соматичної вірусної патології Луганської міської багатопрофільної дитячої лікарні № 4 з 2001 по 2006 рр. Дітей у віці від 2 років до 5 років 11 місяців та 30 днів було 127 (49,03%), у віці від 6 до 14 років - 132 (50,97 %). Легкий перебіг пневмонії зареєстрований у 99 дітей (38,22 %), середньотяжкий перебіг - у 97 дітей (37,45 %), тяжкий перебіг - у 63 дітей (24,32 %). В групі дітей від 2 років до 5 років 11 місяців та 30 днів легкий перебіг гострої пневмонії зареєстрований у 48 осіб (37,80 %), середньотяжкий перебіг - у 44 (34,65 %), тяжкий перебіг - у 35 (27,55 %); в групі дітей від 6 до 14 років - у 51 (38,64 %), 53 (40,15 %) та у 28 (21,21 %) осіб відповідно.
Контрольну групу склали 69 практично здорових дітей у віці від 2 до 14 років, із яких 33 дитини були у віці від 2 років до 5 років 11 місяців та 30 днів, і 36 дітей від 6 до 14 років: хлопчиків було 35 (50,72 %), дівчаток - 34 (49,27 %).
Робота виконувалась у відповідності до біоетичних норм з дотриманням відповідних принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції ради Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України. Всі батьки (а по можливості - і діти) дали письмову згоду на участь у дослідженні.
2.2. Методи досліджень та статистична обробка одержаних результатів
Дослідження проводили при надходженні дітей до стаціонару та при виписці. Кров забирали ранком, натще, з пальця на загальний аналіз і з вени ліктьового згину для імунологічних і біохімічних досліджень. Кров вносили до стерильних скляних пробірок, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували і для одержання плазми відстоювали протягом 2 годин у термостаті при 37?С.
Імунологічні та біохімічні дослідження проводили в науковій лабораторії кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (завідувач кафедри - професор Н.К. Казімірко).
Виділення лімфоцитів з периферійної крові здійснювали в градієнті щільності 1,072 фікол-верографін з наступним лізисом еритроцитів льодяним розчином амонію хлорид. Суцільну кров, розведену в співвідношенні 1:1 середовищем 199, нашаровували на суміш фіколу-верографіну і центрифугували 20 хвилин при 500 g. Зняті інтерфазні кільця мононуклеарних клітин двічі відмивали протягом 10 хвилин середовищем 199. Потім ресуспендували в живильному середовищі. Для підготування суспензії лімфоцитів у концентрації 2 Г/л проводили розрахунок за формулою: В=(а/40-1)*с, де а - кількість лімфоцитів у камері Горяєва; с - кількість суспензії клітин, які залишились у пробірці; В - кількість фосфатно-буферного розчину, який необхідно додати. Використання описаного методу дозволяє виділяти з крові біля 90 % лімфоцитів. Суправітальне фарбування виділених лімфоцитів трипановою синькою свідчило про життєздатність 98-99 % клітин [58, 99, 135].
Популяції моноцитів і нейтрофілів периферійної крові одержували за допомогою центрифугування на подвійному градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну за H.R. Recalde (1994) [52, 95, 137]. Чистоту суспензії моноцитів (89-98 %) підтверджували імунофлуоресцентним методом із використанням моноклональних антитіл до рецепторів CD14. Життєздатність клітин у суспензії підтверджували в тесті з трипановою синькою (вона складала 89-93 %).
Препарати хромосом готували з культур лімфоцитів суцільної гепаринізованої крові. До стерильних флаконів в стерильних умовах вносили 6 мл середовища 199, 5 мл сироватки великої рогатої худоби, 0,2 мл розчину фітогемаглютиніну, розчиненого згідно з інструкцією, та 0,5 мл крові, яка досліджувалась. Флакони зачиняли та інкубували при 37?С протягом 72 годин. За 2-3 години до приготування препаратів до флаконів вносили колхіцин до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл та витримували культури в термостаті при 37?С. По закінченні терміну культивування до флаконів на 20 хвилин вносили 5-7 мл розчину калію хлорид (0,075 моль/л), попередньо підігрітого до 37?С. Після видалення надосадової рідини клітинну визвесь ресуспендували в 5-7 фіксатора Кларка (3 частини етилового або метилового спирту та 1 частина льодяної оцтової кислоти) та інкубували 20 хвилин в холодильній камері. Зміну фіксатора проводили тричі. Потім 8-10 крапель клітинної суспензії наносили на знежирене охолоджене предметне скельце, висушували препарат і фарбували азур-еозином. Урахування результатів проводили за допомогою імерсійної системи світлового мікроскопа. Числові аномалії каріотипу аналізували за критеріями, запропонованими Н.П. Бочковим і співавторами (1972) [1, 22]. Вивчення сестринських хроматидних обмінів (СХО) проводили шляхом додавання 5-бромдезоксиуридіну до культури лімфоцитів за 28-30 годин до їх фіксації, в кінцевій концентрації 10 мкг/мл. Після отримання препаратів хромосом за загальноприйнятою методикою їх на 10 хвилин приміщали до водяного розчину акридіну оранжевого (10 М), промивали водою та висушували. Потім препарати прикривали тонким шаром 0,07 М розчину Na2HPO та опромінювали 15 хвилин ультрафіолетовою лампою СВД-120А на відстані 30-40 см, після чого препарати промивали в проточній воді та обробляли насиченим розчином барію гідроокису при 20-22?С протягом 5 хвилин. Далі препарати промивали, висушували, фарбували протягом 15-20 хвилин 2 % розчином Гімзи, приготованим на фосфатному буфері (рН=6,8). Аналіз кількості СХО проводили під мікроскопом з імерсійною системою.
Визначення кількості тотальних Т-клітин, В-лімфоцитів, Т-хелперів/індукторів та Т-супресорів/цитотоксиків, природних кілерів, а також клітин з маркерами апоптозу проводили методом непрямої імунної флуоресценції з використанням моноклональних антитіл CD3, CD22, CD4, CD8, CD16, CD38, CD95 виробництва науково-виробничого центру "Медбіоспект