Розділ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Об’єкт досліджень. Досліди виконували на 306 щурах-самцях лінії Вістар
масою 0,20-0,22 кг. Враховуючи досить високу лабільність енергопродукуючих
процесів у МХ, в роботі звертали особливу увагу на забезпечення спокійного
стану тварин, оскільки навіть звичайні маніпуляції з ними (відкривання клітки,
перенесення з віварію і т.д.) можуть істотно впливати на різні функціональні
показники. Тварин утримували в стаціонарних умовах віварію при постійній
температурі. Всі маніпуляції з тваринами проводились згідно вимог Міжнародної
Конвенції роботи з тваринами.
У серії досліджень дозових впливів L-аргініну та Nw-нітро-L-аргініну на процеси
енергетичного забезпечення, ПОЛ та активність системи АОЗ тваринам одноразово
внутрішньочеревно вводили: L-аргінін фірми “Sigma”, США у дозах 450 мг/кг, 600
мг/кг, 750 мг/кг, або L-NNА, фірми “Sigma”, США у дозах 5 мг/кг, 35 мг/кг,
50 мг/кг маси тварин.
З метою з’ясування ролі NO-ергічної ланки у регуляції функціонального стану МХ,
процесів ПОЛ та активності системи АОЗ окрему серію досліджень проводили на
тваринах з різною резистентністю до гіпоксії. Резистентність тварин до гіпоксії
визначали за методом В.А. Березовського [8]. Суть методу полягає у різній
здатності тварин перебувати в умовах зниженої концентрації кисню у повітрі.
Величину реакції тварин на гостру гіпоксію оцінювали за часом їх перебування в
умовах розрідженого повітря (що відповідає висоті 12000 м) у барокамері до
появи другого агонального вдиху або судом. У ВР тварин він складав 7 хвилин і
більше, у НР – до 2 хв. Тварин використовували в дослід через 2 тижні після
розділення. Тваринам з визначеною резистентністю одноразово внутрішньочеревно
вводили в об’ємі 1 мл: L-аргінін (600 мг/кг) та L-NNA (35 мг/кг). Час дії
кожного препарату складав 30 хв, після чого проводилось швидке декапітування.
Контролем служили тварини, яким вводили 1 мл фізіологічного розчину.
У наступній серії дослідів з метою визначення ролі адрено- і холінорецепторів у
реалізації ефектів NO-ергічної ланки на процеси енергозабезпечення, ПОЛ та
активність системи АОЗ тваринам одноразово, на фоні дії адреноблокаторів (АБ) –
обзидану (2 мг/кг) та бутироксану (2 мг/кг), або холіноблокаторів (ХБ) –
атропіну (5 мг/кг) та бензогексонію (10 мг/кг) [21], вводили L-аргінін або
L-NNA. Час дії блокаторів адрено- і холінорецепторів, L-аргініну і L-NNA
становив 30 хв.
При дослідженні ефектів введення L-аргініну та Nw-нітро-L-аргініну тваринам з
різною резистентністю до гіпоксії у стресових умовах та у стресових умовах на
фоні блокування адрено- та холінорецепторів використовували екстремальний
вплив, пов’язаний з вільним плаванням щурів у клітці, закритій сіткою, відстань
від води до сітки у якій становила 5 см. Температура води 220С. Час плавання –
30 хв [9]. ВР і НР тваринам перед дослідом вводили внутрішньочеревно в об’ємі 1
мл: фізіологічний розчин, L-аргінін та Nw-нітро-L-аргінін (у вказаних вище
дозах). Час дії кожного препарату складав 30 хв. Контролем служили інтактні
тварини. Тварин декапітували одразу після плавання.
2.2. Метод виділення мітохондрій з печінки щурів. Ізольовані МХ печінки
виділяли за методом, що дає змогу зберігати їх нативність [40]. Видалений з
декапітованих тварин орган зберігали протягом 10 хв в льодяному середовищі
виділення (-20С), яке містило (мМ/л): KCl – 120, Hepes – 10, EГTA – 1, К2СО3 –
2, pH 7,2 [40]. Охолоджену тканину подрібнювали, пропускаючи через прес, і
гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості обертів 300/хв
і 3 вертикальних ходах товкачика. З 8%-го гомогенату центрифугуванням поетапно
осаджували фракцію ядер: 3 хв при 150 g і 4 хв при 300 g без зупинки
центрифуги. Мітохондріальну фракцію отримували центрифугуванням супернатанту
протягом 10 хв при 4500 g. Отриманий непромитий осад регомогенізували вручну
(один вертикальний хід товкачика) з середовищем виділення.
2.3. Полярографічне вимірювання швидкості дихання біологічних суспензій. Метод
базується на реєстрації електрохімічного відновлення фізично розчиненного кисню
на катоді при накладанні потенціалу 0,6-0,7 В [70]:
О2+2Н+ +2е– =Н2О2
Н2О2+2Н++2е– =Н2О
Величину дифузного струму реєстрували за допомогою полярографічної установки,
зібраної на базі закритого електрода Кларка, самописця КСП-4, магнітної мішалки
для розмішування суспензії та скляної термостатованої закритої комірки об’ємом
1 мл. Детальний опис методу наведений у роботі [70]. Типова полярограма
представлена на рис. 2.1. Середовище інкубації містило (мМ/л): KCl – 120,
KH2PO4 – 2, Hepes – 10, К2СО3 – 2, pH 7,2 [40]. У середовище вносили 4-5 мг
мітохондріального білка. Як субстрати окиснення використовували (мМ): сукцинат
– 0,35, альфа-кетоглутарат – 1, піруват – 3, глутамат – 2,5, малат – 2,5. Також
застосовували наступні інгібітори: мітохондріального ферментного комплексу І –
10 мкМ ротенон, сукцинатдегідрогенази (СДГ) – 2 мМ малонат, реакцій
переамінування – 1 мМ амінооксиацетат. Дихання стимулювали додаванням 200
мкмоль АДФ. Розчини усіх речовин, які додавали у комірку, попередньо доводили
до рН середовища інкубації, яке становило 7,2. Температура інкубації становила
260С. Використаний метод дозволяє ідентифікувати метаболічні стани МХ печінки
за Чансом:
стан 2 (V2) – до суспензії МХ доданий екзогенний субстрат. Швидкість дихання
мала, фосфорилювання відсутнє, дихальні переносники в значній мірі відновлені.
стан 3 (V3) – “активний”. МХ забезпечені і субстратом окиснення і АДФ. Дихання
різко зростає, і супроводжується фосфорилюванням з утворенням АТФ, збільшується
концентрація окиснених форм дихальних переносників.
стан 4 (V4) – “контрольований”, у системі відб
- Київ+380960830922