Розділ 2
Матеріали і методи дослідження
2.1. Відбір тварин для дослідження
Досліди проводилися на білих нелінійних щурах-самцях, яких утримували на
стандартному раціоні віварію. В експерименті використано 424 тварини.
Iнтоксикацiю тварин натрію нітритом викликали шляхом дворазового
внутрішньошлункового введення натрію нітриту в дозі 70 мг/кг маси тіла (? ЛД50
) [28] з інтервалом в одну добу. Токсичне ураження печінки моделювали шляхом
одноразового внутрішньошлункового введення 50 % масляного розчину
тетрахлорметану з розрахунку 0,25 мл на 100 г маси тіла тварини , на четверту
добу після першого введення нітриту натрію.
Ентеросорбент “Фібрабет”- біологічно активний додаток (отриманий на кафеді
медичної хімії Тернопільської державної медичної академії і затверджений МОЗ
України) вводили тваринам із розрахунку 1 г/кг маси тіла за допомогою зонда
щоденно протягом усього експерименту. Металокомплекс гістидинат міді
синтезовано на кафедрі медичної хімії ТДМА проф. Я.І. Гонським з гістидину та
гідроксиду металу, які брали в еквімолярних концентраціях. Гістидинат міді
вводили внутрішньошлунково, починаючи з дня першого введення нітриту натрію, в
дозі 0,94 мг/кг (біотична доза міді в крові) [95].
Експерименти проводили на щурах таких вікових періодів: статево-незрілі
(3-місячні, маса 70-120 г) та старі (18-місячні, масою 300 г і більше). Всіх
тварин розділили на п’ять груп: I - iнтактнi, II - ураженi натрію нітритом, III
– уражені натрію нітритом та тетрахлорметаном, IV – ліковані ентеросорбентом
“Фібрабет”, V - ліковані гістидинатoм міді, VI - ліковані ентеросорбентом
“Фібрабет” та гістидинатoм міді. Евтаназію проводили пiд легким ефiрним
наркозом на 1-, 4- та 7-у доби після останнього введення ксенобіотика. Для
досліджень використовували плазму крові, цільну кров та гомогенат печінки.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з “Правилами використання
лабораторних експериментальних тварин”.
2.2. Методи дослідження стану ендогенної інтоксикації
2.2.1. Визначення вмісту молекул середньої маси
Визначення МСМ проводили згідно методики [136], в модифікації [154]. З
сироватки крові виділяли кислоторозчинну фракцію, яку отримували шляхом
додавання до 0,2 мл сироватки 1,8 мл 10 % розчину трихлороцтової кислоти.
Центрифугування проводили при 3000 об./хв на протязі 30 хв. Виділену фракцію в
об’ємі 0,5 мл розводили дистильованою водою у співвідношенні 1:10 і визначали
оптичну густину при довжині хвилі 254 нм та 280 нм проти дистильованої води на
спектрофотометрі СФ-46; результати виражали в одиницях, чисельно рівних
показникам екстинкції.
2.2.2. Визначення еритроцитарного індексу інтоксикації
ЕІІ визначали за методом [175]. В основі методу лежать уявлення про еритроцит
як універсальний адсорбент. В пробірку, яка містила 1 мл 3,8 % розчину натрію
цитрату, відбирали 4 мл крові, перемішували і відділяли еритроцити шляхом
центрифугування на протязі 10 хв при 3000 об./хв. Плазму видаляли. 1мл
еритроцитарної маси переносили в пробірку, яка містила 3 мл розчину
метиленового синього (0,025 %), приготовленого на фізіологічному розчині.
Перемішували і інкубували протягом 10-12 хв при кімнатній температурі. Дальше
центрифугували на протязі 10 хв при 3000 об./хв. Надосадову рідину переносили в
кювету фотоелектроколориметра. Визначали оптичну густину вихідного розчину і
надосадової рідини в одиницях екстинкції колориметричним методом по відношенню
до фізіологічного розчину при довжині хвилі 630 нм.
Кількість поглинутого барвника (у відсотках) вираховують за такою формулою:
А = 100 – Сх100/В, (2.1)
де А – кількість поглинутого барвника, %;
В – оптична густина вихідного розчину, ум. од. екстинкції;
С – оптична густина розчину барвника після інкубації з еритроцитами, ум. од.
екстинкції.
2.2.3. Визначення активності аланін- і аспартатамінотрансфераз
Для визначення активності аланін- і аспартатамінотрансфераз використовували
метод Райтмана і Френкеля [44], який базується на здатності
2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворювати гідразон
піровиноградної кислоти, за інтенсивністю забарвлення якого судять про
активність амінотрансфераз.
Для дослідження брали 0,1 мл сироватки крові або 10 % гомогенату. В пробірки
наливали по 0,5 мл відповідного субстрату і суміш інкубували 30 хв для АлАТ і
60 хв для АсАТ при температурі 37 0С. Після інкубації додавали 0,5 мл
2,4-динітрофенілгідразину і витримували 20 хв при кімнатній температурі.
Припиняли реакцію внесенням у пробу 5 мл розчину NaOH з молярною концентрацією
0,4 моль/л. Через 15 хв проби колориметрували на спектрофотометрі СФ-46 при 545
нм в кюветі довжиною 10 мм проти холостої проби. Холосту пробу готували
аналогічно дослідним, але сироватку (гомогенат) вносили після інкубації.
Розрахунок активності ферменту проводили за допомогою калібрувального графіку,
побудованого для піровинограднокислого натрію і виражали в ммолях
піровиноградної кислоти на 1 л сироватки за 1 год інкубації та в ммолях
піровиноградної кислоти на 1 кг печінки за 1 год інкубації.
2.2.4. Визначення активності кислої фосфатази
Для вивчення активності кислої фосфатази (КФ) користувалися методом Боданского
[44]. Принцип методу базується на здатності бета-гліцерофосфату в кислому
середовищі взаємодіяти з молібденовокислим амонієм і аскорбіновою кислотою. В
результаті утворюється неорганічний фосфат, за вмістом якого можна судити про
активність кислої фосфатази.
Для визначення використовували 0,1 мл сироватки крові або 0,1 мл 10 %
гомогенату. Додавали 1 мл кислого розчину бета-гліцерофосфату і інкубували на
п
- Київ+380960830922